專利名稱：用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法及其用途涉及的是一種生物催化劑包括酶及微生物細胞的固定化新方法及其用途，屬生物工程領域。
酶與細胞固定化就是將具有化學催化活性的蛋白質固定及定位于一定的空間范圍內，實現催化反應。由于它有反應后易于將底物與產物分開，穩定性提高，可反復使用及連續化操作和反應所需空間小等顯著優點，從而與游離酶及細胞相比可大大降低生產成本，提高單位生物反應器體積的生產能力。六十年代以后，國內外都投入了大量人力、物力、財力，對此進行研究，成為當今生物工程的關鍵技術之一。目前發展的固定化方法主要包括吸附法、包埋法、交聯法、化學共價法、徽囊化法、絮凝法等。各種方法各有優缺點，從中還不能找出一種較為普適的固定化方法，已有的固定化方法不是產生固定化后生物催化活性損失大，再生困難等缺點，就是產生生物催化劑易泄漏、脫落或制備困難，固定化費用高的缺點。
近年來，國內外越來越對用膜將酶或細胞限制在一定范圍內形成膜截留固定化法給予極大重視。由于其較好地綜合了上述各種固定化方法的優點，改進了上述各種方法的許多不足，而且操作比較簡單，可以建立數學模型進行計算及選擇不同截留分子量膜，以適應不同底物與產物的要求，當酶或細胞失活以后，更新容易。但近年來發展的膜截留固定化方法也還存在以下幾個主要問題A．pH適用范圍較窄，一般有機高分子膜適用pH為3～12，較多應用的中空纖維膜適用pH為4～8，因此，這類膜不能耐受強酸、強堿，從而限制了其使用范圍及給膜的清洗帶來困難。
B．一般有機膜亦不能耐受很高的溫度，使用溫度正常不超過50℃。
C．一些有機膜在生物催化劑存在的情況下會發生生物降解，有機膜溶脹性差，在細胞增殖過程中易發生破裂。
D．對無機陶瓷膜而言，以氧化鋁為基質，pH應用范圍也較窄，而總的說來，無機膜價格較貴，且其生物相容性很差，難以適合生物物質正常生長及代謝的需求。
本發明的目的是針對上述生物催化劑固定化方法存在不足之處，提供一種用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法及其用途。采用動物(豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等)腸衣膜，對生物催化劑(包括酶及細胞)來進行固定化，由于用動物(豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等)腸衣膜，因而它具有非常好的生物相容性，也具有比有機高分子膜更耐酸、堿，耐有機溶劑，耐溫等更優的性能，比有機高分子膜更難生物降解。而且動物(豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等)腸衣膜原料來源廣，價格低廉，可廣泛應用于各種分子大小生物催化劑的固定化。
用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法及其用途是采取以下方案實現的動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法是采用動物腸衣膜作為膜截留固定化的載體。動物腸衣膜包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等動物腸衣膜。其工藝方法為1．將動物腸衣進行堿、酸及有機溶劑清洗，首先將動物腸衣用堿性溶液浸泡5～48小時(h)，浸泡用堿性溶液可采用氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氨水等中的一種或混合物。溶液濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)，用水漂洗后，再用酸溶液浸泡5～48小時(h)，用水漂洗到中性，浸泡用酸溶液可采用鹽酸、硫酸、甲酸、檸檬酸等中的一種或混合物，溶液濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)。用有機溶劑進一步清洗動物腸衣，用有機溶劑浸泡5～48小時(h)，用水漂洗干凈制成動物腸衣膜備用。有機溶劑包括乙醇、丙酮、甲醇、四氫呋喃等，溶液濃度為0.05％～1.0％(水溶劑)。
2．根據所固定化生物催化劑的顆粒大小決定是否需要預先對生物催化劑進行絮凝，以增加生物催化劑顆粒的大小。對于固定化生物催化劑顆粒較小的生物催化劑進行絮凝，以增加生物催化劑顆粒的尺寸。對于固定化生物催化劑尺寸較小的生物催化劑需進行絮凝，在生物催化劑中加入絮凝劑攪拌均勻，絮凝劑可采用殼聚糖、海藻膠、卡拉膠、明膠、幾丁質等，濃度為1.0ppm～5ppm。
3．將上述經堿、酸及有機溶劑清洗處理過的動物腸衣膜裝入生物催化劑，封口，即制成生物催化劑固定化膜組件。
本發明動物腸衣膜固定化生物催化劑方法是一種采用動物(豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等)腸衣膜截留生物催化劑固定化新方法，可以用于游離酶、完整微生物細胞固定化，多酶體系、輔酶體系及酶催化激活因子協同固定化。同時由于該方法不易受剪切力影響，能耐受高機械強度攪拌，具有很好的生物相容性，因此該固定化方法亦可用于動、植物細胞的培養。
應用時，將裝有生物催化劑的動物腸衣膜固定化組件置入已裝有反應底物溶液的生物反應器中進行反應，反應完畢可將整個動物腸衣膜取出來放入另一個裝有相同反應底物體系的生物反應器中進行反應，如此重復進行多次，也可用連續方式進行操作，不斷地向反應器中加入底物并連續排出產物。該固定化方法可以大大提高酶活回收率，酶活回收率近100％，明顯延長了生物催化劑的半衰期，有的能達到20個月。
本發明采用動物(豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等)腸衣膜固定化新方法及與絮凝法相結合的新工藝，來對生物催化劑(包括酶及細胞)來進行固定化。由于采用改性動物腸衣膜，因而它具有非常好的生物相容性，也具有比有機高分子膜更耐酸、堿、耐有機溶劑，耐溫度等更優的性能，比有機高分子膜更難生物降解。另外，動物腸衣原料來源廣、價格非常低廉，結合絮凝法可廣泛應用于各種分子大小生物催化劑的固定化，這種固定化新方法及新工藝具有廣普性，固定化后生物催化劑活性回收率高，膜內外擴散限制小，生物催化劑活性保留時間長。由于動物腸衣有很好的韌性、機械強度和溶脹性，因此，經這種方法固定化的生物催化劑可適用于較強的機械攪拌和剪切力的工況，且固定化成本很低。
以下結合實施例進一步描述實施例1．本發明方法可采用動物腸衣膜固定化方法生產L-蘋果酸。
將一定長度和尺寸的動物腸衣，包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等動物腸衣用濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)氫氧化鈉溶液，或氫氧化鈣溶液與氫氧化鉀溶液的混合液中浸泡5～48小時(h)，清洗漂洗后再用濃度為0.05～2摩爾/升mol/L鹽酸溶液浸泡5～4小時(h)，再漂洗到中性，最后采用濃度0.05～10％的乙醇溶液浸泡清洗干凈制成動物腸衣膜備用。將培養好的產氨短桿菌MA-2.1kg裝入上述堿、酸及有機溶劑處理好的動物腸衣膜中，封口形成固定化膜組件，在1摩爾/升(mol/L)富馬酸鈉底物中進行反應，反應溫度為37℃,pH為7.0，時間為3.5小時(h)，平均轉化率達81.5％(即平衡轉化率)然后進行分離、純化，制備L-蘋果酸成品。采用本發明，固定化單位菌體延胡縈酸酶活回收率達100％，不存在內外擴散問題，操作半衰期可達18個月。
實施例2．采用本發明方法生產L-天冬氨酸。
將一定長度和尺寸的動物腸衣包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等動物腸衣，用濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)氫氧化鉀溶液浸泡5～48小時(h)，清水漂洗后，再用濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)的硫酸溶液或硫酸與鹽酸的混合液浸泡5～48小時(h)再漂洗到中性，最后采用0.05～10％的丙酮溶液浸泡、清洗干凈制成動物腸衣膜備用。將培養好的富含天冬氨酸酶的大腸桿菌(E.coli No.1)0.5kg加入1毫摩爾/升(mmol/L)Mg2+并采用絮凝劑海藻膠進行絮凝，裝入上述動物腸衣膜中封口制成固定化膜組件，通入1摩爾/升(mol/L)富馬酸銨，停留時間為3.5h，平均轉化率達99.9％，然后進行分離提取，平均1kg富馬酸能轉化生成1.08kg醫藥級的L-天冬氨酸，總收率達94％以上，半衰期長達20個月，而且無需在底物溶液中連續不斷添加微量Mg2+，顯著降低了操作成本。
實施例3．采用本發明方法由葡萄糖異構化酶生產D-果糖。
將一定長度和尺寸的動物腸衣包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等動物腸衣，用濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)氨水溶液浸泡5～48小時(h)，清水漂洗后，用濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)的檸檬酸溶液浸泡5～48小時(h)，再清洗到中性，最后采用0.05～10％的四氫呋喃溶液浸泡，清洗干凈制成動物腸衣膜備用。將丹麥NOVO公司購買的葡萄糖異構化酶(Glucose Isomerases.EC.5.3.1.5)200g經殼聚糖絮凝后裝入動物腸衣膜中，封口制成動物腸衣固定化膜組件，在葡萄糖濃度為20％,pH為7.0,65℃下反應2h，其轉化率達42％，反應基本達到平衡轉化率，采用本發明固定化方法，游離葡萄糖異構化酶回收率高達100％，且產物與游離酶易于分離，固定化葡萄糖異構化酶半衰期達100天。
權利要求
1．一種用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法，其特征是采用動物腸衣膜作為膜截留固定化的載體，其工藝方法為(1)．將動物腸衣進行堿、酸及有機溶劑清洗，首先將動物腸衣用堿性溶液浸泡5～48小時，溶液濃度為0.05～2摩爾/升，用水漂洗至中性后，再用酸溶液浸泡5～48小時，用水漂洗到中性，溶液濃度為0.05～2摩爾/升；用有機溶劑進一步清洗動物腸衣，用有機溶劑浸泡5～48小時(h)，用水漂洗干凈制成動物腸衣膜備用；(2)．對于尺寸較小的生物催化劑可預先進行絮凝，在生物催化劑中加入絮凝劑攪拌均勻；(3)．將上述經堿、酸、有機溶劑清洗處理過的動物腸衣膜裝入生物催化劑，封口即制成動物腸衣膜固定化組件。
2．根據權利要求1所述的用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法，其特征是動物腸衣膜包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等腸衣膜。
3．根據權利要求1所述的用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法，其特征是浸泡用堿性溶液可采用氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀及氨水中的一種或混合物，溶液濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)。
4．根據權利要求1所述的用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法，其特征是浸泡用酸溶液可采用鹽酸、硫酸、甲酸、檸檬酸中的一種或混合物，溶液濃度為0.05～2摩爾/升(mol/L)。
5．根據權利要求1所述的用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法，其特征是清洗用有機溶劑包括乙醇、丙酮、甲醇、四氫呋喃。
6．根據權利要求1所述的用動物腸衣膜固定化生物催化劑方法的用途，其特征是動物腸衣膜截留生物催化劑固定化方法可用于游離酶、完整微生物細胞固定化，多酶體系、輔酶體系、酶催化激活因子協同固定化以及動植、物細胞的培養。
全文摘要
本發明用動物腸衣膜固定化生物催化劑的方法及其用途涉及的是一種生物催化劑包括酶及微生物細胞的固定化新方法及其用途。其方法為:將動物腸衣進行堿、酸及有機溶劑清洗,對于固定化生物催化劑尺寸較小的生物催化劑進行絮凝,將生物催化劑裝入上述清洗處理過的動物腸衣膜,封口制成動物腸衣膜固定化組件。本發明方法可用于游離酶、細胞的固定化,多酶體系、輔酶體系、酶催化激活因子協同固定化以及動、物細胞的培養。
文檔編號C12N11/04GK1307131SQ0011205
公開日2001年8月8日 申請日期2000年1月26日 優先權日2000年1月26日
發明者沈樹寶, 胡永紅 申請人:沈樹寶, 胡永紅