專利名稱：擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，具體屬于一種擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法。
體外基因擴(kuò)增技術(shù)也稱聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，是80年代中期由Mullis發(fā)明的一種新的分子生物技術(shù)(美國專利4,965,188)。該技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室的試管內(nèi)，將所要研究的一個基因或一個基因片段在數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增成百萬倍至千百萬倍。采用一種耐熱的脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶(Taq酶)一對與目的DNA片段兩端互補(bǔ)的引物及其它核酸擴(kuò)增原料，在變性、退火、延伸三個階段反復(fù)循環(huán)下，目的基因即按指數(shù)倍(2n)擴(kuò)增。該技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)的一項革命性創(chuàng)舉，并在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域廣泛使用。該技術(shù)應(yīng)用時，將Taq酶、一對引物、核酸擴(kuò)增原料(dNTP)、Mg2+等置于一個溶液中，并利用熱循環(huán)儀實(shí)施擴(kuò)增。但是，當(dāng)要擴(kuò)增多個基因或基因片段時，由于每個目的片段的引物和擴(kuò)增產(chǎn)物全都集中在一個溶液中，互相之間有干擾，使得結(jié)果不準(zhǔn)確。故以往要擴(kuò)增某個樣本中的多個基因時，采用的是將樣本分為多份，分別置于不同的擴(kuò)增溶液中進(jìn)行。這樣，當(dāng)使用該方法分析某個樣本中多個基因或基因片段，尤其是對成百上千個基因時，就非常耗時費(fèi)力。尤其當(dāng)某些稀有樣本，由于樣本量非常少，不足以分為多份進(jìn)行擴(kuò)增，難以實(shí)現(xiàn)分析多個基因或基因片段。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有擴(kuò)增技術(shù)中存在的缺陷，提供一種可在一個擴(kuò)增溶液中同時擴(kuò)增樣品中多個基因或基因片段的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特點(diǎn)是分別將欲擴(kuò)增的多個基因/基因片段的每對引物中的一個定點(diǎn)固化在固相支持物上，另一個則放入擴(kuò)增溶液中，反應(yīng)時將該固化有多個基因/基因片段引物的固相支持物浸沒于該擴(kuò)增溶液中，利用多聚酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因/基因片段的擴(kuò)增。
上述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其中，所述定點(diǎn)固相化在固相支持物上的引物是先合成后再對其進(jìn)行化學(xué)修飾或增加一段連接臂。
上述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其中，對所述合成后的引物化學(xué)修飾或增加連接臂是在其5’端進(jìn)行。其中，所述5’端修飾的引物為一磷酸基因的引物。
上述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其中，所述引物的5’端與固相支持物共價結(jié)合。
上述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其中，所述固相支持物是指各種膜材料、玻璃材料、塑料材料或硅基材料。其中，尤以聚苯乙烯材料為佳。
本發(fā)明采用了將引物對中的一個固相化在固相支持物上，這樣可以使所有的擴(kuò)增產(chǎn)物都結(jié)合在固相支持物上，多個基因或基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物不會互相干擾。多對引物之間的干擾也大為減少，從而使在一個擴(kuò)增溶液中擴(kuò)增多個基因得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于基因微陣列檢測技術(shù)、基因芯片的制造或生產(chǎn)基因診斷儀器等領(lǐng)域。
實(shí)施時，首先將要擴(kuò)增的目的基因片段的引物對設(shè)計好。設(shè)計引物時最好避免引物之間形成互補(bǔ)或發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的序列，同時要求這些引物的退火溫度越接近越佳，不宜超過10℃。引物合成的方法沒有限制，通常采用基因合成儀化學(xué)合成的方法取得。合成好的引物要將上下游引物分別放置，每對引物中挑選一個引物，上、下游引物不限，將其固相化在固相支持物上，另一個引物將放在擴(kuò)增溶液中。固相支持物沒有特殊的限制，只須能與引物牢固結(jié)合，通常可選用各種膜材料、玻璃材料、塑料材料或硅基材料等。引物與固相支持物的結(jié)合方法沒有限制，通常包括非特異吸附，各種方法導(dǎo)致的共價結(jié)合，或利用電荷的吸附等，吸附得越牢越好。引物與固相物結(jié)合時不能將引物3’端的化學(xué)基團(tuán)與固相物共價結(jié)合，否則將影響擴(kuò)增。為了提高擴(kuò)增效率，通常將引物的5’端與固相支持物上的某些化學(xué)基關(guān)共價結(jié)合。為了便于共價結(jié)合或者使引物在溶液中有一定的自由活動度，也可將引物的5’端進(jìn)行各種化學(xué)修飾或接上各種連接臂。多個引物在固相支持物上的定位可以通過手工或儀器輔助來進(jìn)行，此類方法屬已有技術(shù)，故不贅述。
基因擴(kuò)增時，將樣本與擴(kuò)增原料、耐熱DNA聚合酶和未固化的對應(yīng)引物及擴(kuò)增緩沖液組成擴(kuò)增溶液，將已定點(diǎn)固化了多個引物的固相支持物浸沒在溶液中。擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)與普通擴(kuò)增參數(shù)相比沒有特殊限制，視擴(kuò)增效果來作適當(dāng)調(diào)整。為了便于后續(xù)的檢測，擴(kuò)增時可在擴(kuò)增原料中摻入標(biāo)記物。標(biāo)記物是指用后續(xù)方面能檢測的一種化學(xué)物質(zhì)。通常有放射性同位素標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物、卵白素標(biāo)記物、地高辛標(biāo)記物、酶標(biāo)記物。擴(kuò)增后將固相支持物取出，然后作適當(dāng)?shù)钠矗吹哪康氖侨コ恍┓翘禺愋缘男盘?。漂洗的溶液沒有特殊限制，但該溶液不能將固化在支持物上的引物和產(chǎn)物洗下。檢測的目的基因或基因片段的方法可以多種多樣。若在擴(kuò)增時已摻人了標(biāo)記物，則用相應(yīng)的方法檢測標(biāo)記物即可。也可以再進(jìn)行一次序列特異的雜交方法來檢測。所謂序列特異的雜交指的是利用核酸雜交的原理，設(shè)計能與已擴(kuò)增片段特異性結(jié)合的核酸探針，再利用核酸雜交的方法檢測。檢測時觀察信號的方法可以是多樣的，通常有肉眼觀察、顯微鏡觀察或成像或計算機(jī)輔助掃描分析方法。
以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明不限于此例在同一反應(yīng)溶液中同時檢測生殖道常感染的病原體，包括淋球菌、衣原體和乳頭狀瘤病毒，三種目的基因片段擴(kuò)增引物如下
上表中，乳頭瘤病毒序列中的R=A+G,M=A+C,W=A+T,Y=C+T，將上述3對引物中的L1、Y1、H1三個引物定點(diǎn)點(diǎn)在一張0.5cm×1cm長方形的聚苯乙烯片上，該三個引物合成時，在5’端修飾一個磷酸根基團(tuán)。點(diǎn)樣前，應(yīng)先將聚苯乙烯片進(jìn)行處理，處理過程如下將聚苯乙烯片置于5％高錳酸鉀1.2當(dāng)量的硫酸溶液中，60℃30分鐘；再置于6當(dāng)量鹽酸溶液中，25℃20分鐘；取出用雙蒸水漂洗五次，漂洗時溫度25℃。處理完畢后，將5’磷酸標(biāo)記的3個引物(濃度為各100mmol/L)，分別置于100mM嗎啉磺酸乙烷(PH6.0)緩沖液(該緩沖液含0.1％碳化二亞胺，10mM N-甲基-1,3-丙二胺)手工定點(diǎn)點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后置于保溫濕盒內(nèi)25℃2小時，取出后用含0.05％曲通X-100的生理鹽水洗五遍。最后用雙蒸水洗5遍。
擴(kuò)增液體積為150μl，擴(kuò)增緩沖液的組成如下1×PCR緩沖液(含Mg2+)dCTP 300μmol/LdATP 300μmol/LdGTP 300μmol/LdTTP 150μmol/L生物素標(biāo)記dUTP 150μmol/L三個對引物中非固化的引物各 500μmol/LTaq酶5u樣本DNA 20μl樣本為外生殖器分泌物及脫落上皮，取適量樣本置于細(xì)胞裂解液中(10mmol/L Tris-HCl PH7.4；10mmol/L EDTA；0.4％SDS；1.0mg/ml蛋白酶)37℃過夜，然后95℃煮10分鐘，取20μl作樣本。擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)為95℃1分鐘，54℃3分鐘，72℃1分鐘，共30個循環(huán)。擴(kuò)增時將上述聚苯乙烯片浸沒于反應(yīng)液中，擴(kuò)增后取出，置于漂洗液(10mmol/L的磷酸緩沖液含0.5％的曲通X-100)中漂洗3次。下一步為顯色步驟，同一般的免疫組織化學(xué)通用方法，過程如下將聚苯乙烯片置于過氧化物酶標(biāo)的卵白素溶液中30分鐘，取出后用漂洗液漂洗3次，最后置于DAB底物中顯示，肉眼或顯微鏡觀察結(jié)果，扣除背景后，有顯色的為陽性，未顯色的為陰性，從而判斷有否感染上述三種病原體。
權(quán)利要求
1．一種擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征在于分別將欲擴(kuò)增的多個基因/基因片段的每對引物中的一個定點(diǎn)固化在固相支持物上，另一個則放入擴(kuò)增溶液中，反應(yīng)時將該固化有多個基因/基因片段引物的固相支持物浸沒于該擴(kuò)增溶液中，利用多聚酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因/基因片段的擴(kuò)增。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于所述定點(diǎn)固相化在固相支持物上的引物是先合成后再對其進(jìn)行化學(xué)修飾。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于所述定點(diǎn)固相化在固相支持物上的引物是在合成后再對其增加一段連接臂。
4．根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于對所述合成后的引物化學(xué)修飾或增加連接臂是在其5’端進(jìn)行。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于所述5’端修飾的引物為修飾一磷酸基團(tuán)的引物。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于所述引物的5’端與固相支持物共價結(jié)合。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于所述固相支持物是指各種膜材料、玻璃材料、塑料材料或硅基材料。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法，其特征還在于所述固相支持物是由聚苯乙烯材料制成。
全文摘要
擴(kuò)增多個基因/基因片段的方法,其特點(diǎn)是將欲擴(kuò)增基因或基因片段的每對引物中的一個定點(diǎn)固定在固相支持物上,另一個放在擴(kuò)增液中。反應(yīng)時將固化有多個基因/基因片段引物的固相支持物浸沒于擴(kuò)增溶液中,利用多聚酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因/基因片段的擴(kuò)增。這樣,多個基因/基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物不會互相干擾,多對引物之間的干擾也大為減少,而可在同一擴(kuò)增溶液中同時擴(kuò)增多個基因/基因片段。適于一生物樣品多個基因/基因片段的分析,尤適于樣本量極少的稀有樣本多個基因/基因片段的擴(kuò)增。
文檔編號C12Q1/68GK1311308SQ00111790
公開日2001年9月5日 申請日期2000年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者姚見兒 申請人:上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司