專利名稱：一種生產(chǎn)基因工程重組人溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種用基因工程重組法生產(chǎn)人溶菌酶的方法。
目前，人溶菌酶主要從人奶和胎盤組織中提取獲得，其來源有限，提取復雜，產(chǎn)量很低，易受人疾病的病源菌污染，所以主要用于科學研究使用，無法供臨床應用。另外從雞蛋中提取的雞溶菌酶，產(chǎn)量高，來源容易，但由于異種蛋白有較強的過敏反應，不適合用于人體，只限于做化裝品使用。
本發(fā)明的目的是要提供一種能夠較大批量生產(chǎn)純凈人溶菌酶的方法。
本發(fā)明的解決方法是運用分子生物學技術(shù)和基因工程技術(shù)，將人溶菌酶基因克隆入酵母菌體內(nèi)進行表達，然后通過提取、純化制出人溶菌酶。
具體由以下步驟完成一、獲取人溶菌酶基因從人白細胞中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行多聚鏈式反應(PCR)擴增出人溶菌酶基因。
二、表達系統(tǒng)用真核表達載體pPIC9K與畢赤酵母宿主菌SMD1168(his4,pep4)進行人溶菌酶表達。
三、提取人溶菌酶。
本發(fā)明由于利用基因工程重組技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)人溶菌酶，能夠較大批量生產(chǎn)人溶菌酶，又避免了從組織中提取易受病源污染的問題，其產(chǎn)品具有穩(wěn)定、純凈的特點。
下面的實施例，附圖
可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明。
實施例一、獲取人溶菌酶基因從人外圍白細胞中提取細胞總RNA，根據(jù)溶菌酶基因序列合成引物，用下游引物P2、異性引物(P1P2)進行聚合酶鏈式反應PCR,PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體在T4DNA連接酶作用下進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Top10)感受細胞，鋪在加氨芐青酶素的LB平板上，37℃生長過夜。挑取4個克隆分別接種于含有氨芐青酶素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。收集菌體，按照常規(guī)方法小量抽提質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定確定陽性克隆。用雙脫氧鏈終止法進行核甘酸序列分析，結(jié)果與發(fā)表的人溶菌序列完全一致。用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pGEM-T-hIy質(zhì)粒，膠回收hIy基因片段。用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pPIC9K表達載體，膠回收pPIC9K線性化質(zhì)粒DNA。hIy基因片段與pPIC9K線性化質(zhì)粒DNA，在T4DNA連接酶作用下進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Top10)感受細胞，鋪在加氨芐青酶素的LB平板上，37℃生長過夜。挑取4個克隆分別接種于含有氨芐青酶素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。收集菌體，按照常規(guī)方法小量抽提質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定確定陽性克隆。
二、重組質(zhì)粒pPIC9K-hIy構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-hIy構(gòu)建由附圖表述。
三、重組SMD1168-hIy工程菌株的選篩將重組pPIC9K-hIy質(zhì)粒經(jīng)Bg/11酶切線性化后，用電穿孔法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母細胞內(nèi)，通過0.5-5mg/ml G418(氨基糖甙類抗菌素)壓力篩選5mg/ml G418的轉(zhuǎn)化子被篩選出，經(jīng)PCR檢測人溶菌酶基因穩(wěn)定整合到畢赤酵母菌染色體上，該菌株命名為Recombinant SMD1168-hIy strain簡稱人溶菌酶基因工程菌。
四、基因工程重組人溶菌酶生產(chǎn)工藝工程菌接種于BMGY培基中，在30℃條件下發(fā)酵36小時，離心收菌加入BMMY培基中，誘導表達，在30℃條件下發(fā)酵24-72小時，離心、收取上清液，截留分子量10KD超濾器、超濾收取濃縮液，經(jīng)過SP離子交換層析柱，連續(xù)洗脫留取活性峰液，鑒定分裝凍干，即為成品。
經(jīng)過SDS-PAGE結(jié)果證明電泳是一條帶，其蛋白分子量大約為15KD,western blot證實，具有天然人溶菌酶的屬性，溶菌酶活力的測定是用濁度減低法，比商品雞溶菌酶活力高1-3倍，用平板溶圈法實驗，臨床標本分離的對常用抗菌素耐藥的細菌，均對人溶菌酶敏感，展示了具有很好的應用前景，是一種比較理想的消炎、抗菌類藥物。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)基因工程重組人溶菌酶的方法，由以下步驟完成一、獲取人溶菌酶基因從人白細胞中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行多聚鏈式反應(PCR)擴增出人溶菌酶基因；二、表達系統(tǒng)用真核表達載體pPIC9K與畢赤酵母宿主菌SMD1168(his4,pep4)進行人溶菌酶表達；三、提取人溶菌酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人溶菌酶的方法，獲取人溶菌酶基因的步驟為從人外圍白細胞中提取細胞總RNA，根據(jù)溶菌酶基因序列合成引物，用下游引物P2、異性引物(P1P2)進行聚合酶鏈式反應PCR,PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體在T4DNA連接酶作用下進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Top10)感受細胞，鋪在加氨芐青酶素的LB平板上，37℃生長過夜；挑取4個克隆分別接種于含有氨芐青酶素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；收集菌體，按照常規(guī)方法小量抽提質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定確定陽性克隆；用雙脫氧鏈終止法進行核甘酸序列分析，結(jié)果與發(fā)表的人溶菌序列完全一致；用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pGEM-T-hIy質(zhì)粒，膠回收hIy基因片段；用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pPIC9K表達載體，膠回收pPIC9K線性化質(zhì)粒DNA；hIy基因片段與pPIC9K線性化質(zhì)粒DNA，在T4DNA連接酶作用下進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Top10)感受細胞，鋪在加氨芐青酶素的LB平板上，37℃生長過夜；挑取4個克隆分別接種于含有氨芐青酶素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。收集菌體，按照常規(guī)方法小量抽提質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定確定陽性克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人溶菌酶的方法，重組SMD1168-hIy工程菌株的選篩步驟為將重組pPIC9K-hIy質(zhì)粒經(jīng)Bg/11酶切線性化后，用電穿孔法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母細胞內(nèi)，通過0.5-5mg/ml G418(氨基糖甙類抗菌素)壓力篩選5mg/ml G418的轉(zhuǎn)化子被篩選出，經(jīng)PCR檢測人溶菌酶基因穩(wěn)定整合到畢赤酵母菌染色體上，該菌株命名為Recombinant SMD1168-hIy strain簡稱人溶菌酶基因工程菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人溶菌酶的方法，提取工藝為工程菌接種于BMGY培基中，在30℃條件下發(fā)酵36小時，離心收菌加入BMMY培基中，誘導表達，在30℃條件下發(fā)酵24-72小時，離心、收取上清液，截留分子量10KD超濾器、超濾收取濃縮液，經(jīng)過SP離子交換層析柱，連續(xù)洗脫留取活性峰液，鑒定分裝凍干，即為成品。
全文摘要
一種生產(chǎn)基因工程重組人溶菌酶的方法,是運用分子生物學技術(shù)和基因工程技術(shù),將人溶菌酶基因克隆入酵母菌體內(nèi)進行表達,然后通過提取、純化制出人溶菌酶。本發(fā)明由于利用基因工程重組技術(shù),發(fā)酵生產(chǎn)人溶菌酶,能夠較大批量生產(chǎn)人溶菌酶,又避免了從組織中提取易受病源污染的問題,其產(chǎn)品具有穩(wěn)定、純凈的特點。
文檔編號C12N15/79GK1325958SQ0011046
公開日2001年12月12日 申請日期2000年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月26日
發(fā)明者張福琴, 安米, 安獻祿, 張華 , 賈向志, 董輝, 馬文煜, 李元, 李育陽, 袁漢英 申請人:長春奇龍生物技術(shù)研究所