生長抑素基因工程體及其活載體疫苗的制作方法

專利名稱：生長抑素基因工程體及其活載體疫苗的制作方法
技術領域：
本發明生長抑素基因工程體及其活載體疫苗(激生1號疫苗)，屬于生物技術高科技研究領域，專用于免疫家畜，通過激素免疫調控，促進家畜生長，提高畜產品產量。
神經內分泌系統在調控動物生長，胴體組成和繁殖性能方面起核心作用。利用外源激素來調節神經內分泌系統，以提高家畜的生產性能和飼料報酬，國內外已有許多報道。最為熟知的是用固醇類和β-激動劑類化合物用以提高家畜生產性能，這就是第一代促生長劑。但此類制劑由于殘留問題和對人類健康的影響，而被列為國際禁用。第二代促生長劑為生長激素(GH)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，兩者均可加速動物生長。目前已開始使用重組GH和IGF-1，但它們的半衰期短，需要連續注射，給生產上應用帶來不便，且存在一定的激素殘留，而影響使用。第三代的生長促進劑是利用生長抑素(SS)免疫中和調節機理，用化學合成的SS制備的合成肽疫苗主動免疫，或用SS抗血清被動免疫均能中和體內SS，促進內源性GH和IGF-1釋放增加，從而促進動物生長。其增重率在5～10％左右，但因SS合成肽疫苗和SS抗血清生產成本都很高，難以推廣應用。
本發明的目的是研制一種能有效地促進各種家畜生長，提高飼料報酬、成本低廉而又安全性高，無激素殘留，無潛在危險又不降低畜產品質量的基因工程活載體疫苗。
本發明的實施方案如下1、生長抑素基因工程體—重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)，其構建方法為1、1)SS基因合成 SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′用380型DNA自動合成儀合成A52和A23 2個兩端有酶切位點的SS基因片段A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′A23將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基因克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質粒；BamHI 12345678910 11 12 13 14 stop5′-GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC ATTCGAAHindIII1、2)SS基因與HBsAg融合基因的構建從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC12-ss質粒，構建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss質粒；1、3)HBs/ss表達質粒的構建 將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質粒；1、4)帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆將pGJP-HBs/ss轉染，經痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質粒中外源基因插入部位的兩側帶有痘苗病毒TK基因的同源序列，可與痘苗病毒基因組同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。
2、生長抑素基因工程活載體疫苗，其配制方法如下2、1)雞胚苗的接種、收獲 取生產用重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒種，用滅菌生理鹽水稀釋1000-10000倍，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，置35～37℃繼續孵育，每天照蛋1-2次，取48小時至120小時死胚及120小時活胚，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內結凍保存，用于制苗。
2.2)半成品檢驗 取樣作無菌檢查，應無細菌生長。
2.3)配苗 將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過。
2.4)分裝、凍干 將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行。
2.5)瓶器與包裝 按《獸醫生物制品規程》進行。
本發明與現有技術相比其優點和積極效果表現在構建了一株可用于生產生長抑素基因工程活載體疫苗的基因工程體。該工程體能在靶動物(哺乳動物)體內復制增殖，并不斷分泌HBsAg/ss融合蛋白。此表達產物能組裝成大小20nm左右的病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性，能誘導動物產生抗HBsAg和SS兩種抗體，后者能中和SS，促進內源性生長激素(GH)分泌增加，進一步促使胰島素樣生長因子-1(IGF-1)分泌增加，從而加速動物生長；前者能防治近年來大量報道的動物類乙型肝炎，起到一箭雙雕的作用。
本發明首次提出應用雞胚培養增殖重組痘苗病毒制備SS活載體疫苗。生產乙肝表面抗原(HBsAg)的重組痘苗病毒(vTH2)通常采用Vero細胞培養，我們對在vTH2的HBs基因上插入SS基因的新的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)分別在Vero細胞和雞胚絨毛尿膜上培養，比較病毒增殖和基因表達水平。結果發現，在雞胚培養上vv-HBs/ss的空斑數遠遠超過Vero細胞培養，幾乎是細胞培養的100倍；HBsAg和SS的表達量也為細胞培養的7倍。不僅大大改進了用Vero細胞生產HBsAg的常規方法，并且避開了用Vero細胞制備活苗，難以通過完全性評估的難題。
vv-HBs/ss經豚鼠角膜痕試驗和家兔皮內接種試驗表明其毒力已較原痘苗病毒顯著減弱，接種靶動物11天后即不帶毒，在病毒增殖期內不排毒，不引起同居感染。用以制備生長抑素活載體苗(激生1號疫苗)，免疫豬、牛、羊、兔均十分安全，未見有不良反應，并均獲得顯著的增重效果。可用以制備能有效地促進各種家畜生長，提高飼料利用率，成本低，容易生產，而又安全性高，無激素殘留，無潛在危險的新型基因工程疫苗。該設苗于1999年3月和9月2次向農業部農業生物遺傳工程評價委員會申請生長抑素基因工程疫苗商品化生產評價。于2000年12月批準同意，在川、蘇2省進行商品化生產。


圖1 SS基因初級克隆質粒的改造與鑒定示意2 生長抑素基因與乙型肝炎病毒表面抗原基因的融合及其克隆圖3 HBs/ss基因痘苗病毒轉移質粒pGJP-HBs/ss的構建B，BamHI；E，EcoR I；H，HindIII；Sac I；Sal，Sal I；Acc，Acc I；Bg，Bgl II；sm，sma I；Xh，Xho I；HBs，HbsAg，ss，Somatostatin圖4 免疫家兔血清中ss含量變化及ss抗體，HbsAg抗體產生的動態曲線a.ss抗體的動態曲線 b.HB3Ag抗體的動態曲線 c.SS含量的動態曲線vv-ss/HBs免疫家兔 vTH2病毒陰性對照家兔 未經任何處理的空白對照家兔圖5 免疫大鼠與對照組大鼠體增重曲線比較(a)1為免疫組，2為陰性對照組(b)1為免疫組，2為空白對照組實施例(一)基因工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)的構建1.SS基因合成 SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′用380型DNA自動合成儀合成A52和A23 2個兩端有酶切位點的SS基因片段
A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′A23將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質粒。
BanHI 12 345678910 11 12 13 14 stop5′-GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC ATTCGAAHindIII2.SS基因與HBsAg融合基因的構建從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC12-ss質粒，構建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss質粒(見
圖1)。
3.HBs/ss表達質粒的構建 將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質粒。此重組基因在大腸桿菌胞漿內隨質粒的復制而復制，不與細菌染色體DNA融合，具有良好的安全性(見圖2)。
4.帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆轉基因方法為同源重組，將pGJP-HBs/ss轉染，經痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質粒中外源基因插入部位的兩側帶有痘苗病毒TK基因的同源序列。因而可因同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)，該痘苗病毒的TK基因，因插入外源基因而失活(見圖3)。
(二)疫苗的制備(重組痘苗病毒的增殖和表達)1.在Vero細胞上增殖和表達vv-HBs/ss接種Vero細胞37℃4h后，加營養液培養72h收獲。在Vero細胞上測定空斑單位(PFU)并用ELISA測定HBsAg含量，用RIA測定SS含量。結果病毒產量為5×106～107PFU/106細胞。SS表達水平為19.3ng/106細胞，其中分泌液中10.9ng，細胞內8.4ng，對照培養物中無SS。HBsAg表達量為5800ng/106細胞，其中分泌液中3420ng，細胞內2380ng。表達產物分別用SS抗體和HBsAg抗體免疫沉淀后，作電鏡檢查，結果均測定到大小20nm左右的病毒樣顆粒，與報道的HBsAg顆粒，大小，形態完全一致。表明本基因工程體表達產物為顆粒性多價抗原，具有SS和HBsAg 2種抗原表位。
2.在雞胚中增殖和表達vv-HBs/ss接種11日齡雞胚絨毛尿膜，繼續孵化，120h后，收獲帶痘斑的絨毛尿膜和尿囊液，高速勻漿后，在Vero細胞上測定vv-HBs/ss空斑單位(PFU)并用RIA和ELISA測量SS，HBsAg表達水平。結果收獲114只雞胚，除4只污染外，其余的絨毛尿囊膜上均產生明顯痘斑，其大小為0.2～3.0nm。病毒產量平均為5×108～10×108PFU/胚。尿囊液中HBsAg量平均為12.0μg/胚，絨毛尿囊膜勻漿液中為24.0μg/胚，總量約36.0μg/胚。SS表達量在尿囊液中為48ng/胚，絨毛尿囊膜勻漿液中為90ng/胚，總量約138.0ng/胚。見下表重組痘苗病毒在雞胚和細胞培養中增殖與表達的比較<
雞胚培養無論病毒產量(PFU/胚)和HBsAg和SS表達量均顯著高于細胞培養，幾乎是細胞培養的100倍，且雞胚培養方法簡易，收獲絨毛尿膜上的痘斑，勻漿后即可直接配苗，成本低廉，應可作為本疫苗生產的首選方法。
(三)生長抑素基因工程疫苗實驗室小試1.家兔免疫試驗家兔(新西蘭純種，雄性，1.5kg/只)皮內注射重組病毒vv-HBs/ss，1×10-8PFU/只，分背部6點注射。只帶HBs基因的重組痘苗病毒(vTH2)免疫家兔作陰性對照。未經任何處理的兔為空白對照。每間隔一周采血分離血清，以備測定抗體和SS水平，至第12周為止。SS抗體及SS含量測定用RIA方法，HBsAg抗體用酶標免疫法測定。
家兔免疫試驗主要用于檢測SS疫苗能否刺激SS抗體產生，進而使SS水平下降。本試驗只用了3只家兔進行試驗。其結果見圖4。vv-HBs/ss免疫兔在第2，5周血清中出現SS抗體陽性，與空白兔血清測定的cpm之比(P/N)大于2.1，其中第5周出現的抗體峰較為明顯。vTH2陰性對照兔和空白兔血清中未測出ss抗體的產生，免疫兔第2、5周出現HBsAg抗體峰，與SS抗體產生的時間極相吻合。見圖4(a、b)。
免疫兔從第2周開始出現SS含量下降，第4、5周出現第2個較明顯的SS含量下降谷，SS含量為30-40pg/ml，第7周回升到正常水平，陰性對照和空白兔血清中SS含量都在90-190pg/ml之內波動，免疫兔SS顯著下降時期與SS抗體上升峰相符。見圖4(c)。
2.大白鼠免疫試驗大白鼠(SD品系，雄性，約100g/只)分3組，免疫組(7只)背部3點皮內注射vv-HBs/ss。1×107PFU/只。陰性對照組9只，同樣劑量及部位注射vTH2。另10只為空白組。免疫組在第30日，用純化的HBsAg/ss雜合顆粒(9μg/只)皮下注射以強化免疫一次，每間隙5天稱重一次，第55天捕殺動物，數據以平均值標準差表示，并經t-檢驗。
結果，vv-HBs/ss免疫組大鼠的增重比vTH2陰性對照組和空白組大鼠增重快，在第2次免疫后尤為明顯。從共觀察的55天的結果顯著，免疫組平均日增重5.20g，陰性對照組4.43g，空白組4.67g，即免疫組比陰性組增重提高17.3％(p＜0.05)，比空白組提高11.3％(p＜0.05)。見圖5。
(四)疫苗的中試生產1.種毒1.1種毒來源 由南京農業大學生長抑素基因工程疫苗研究課題構建，并提供成都藥械廠作為中試生產的種毒。
1.2種毒基本特性 本疫苗種毒為南京農業大學構建的遺傳工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)，是將HBsAg/ss嵌合基因插入痘苗病毒的TK基因中，構建而成。其基本特性同痘苗病毒，能在多種細胞培養和雞胚絨毛尿膜上生長。人工接種能感染各種哺乳動物。病毒能在宿主體內復制，并持續一定時間。在此期間能不斷釋放基因的表達產物——HBsAg/ss融合蛋白。它能聚合形成大小20nm左右的病毒樣顆粒，是一種顆粒性多價免疫原，能刺激動物產生抗SS和抗HBsAg抗體。前者能中和SS，從而促進GH和IGF釋放，促使動物生長；后者能防治動物的類乙型肝炎。因此本遺傳工程體是一種既能促長，又能防病的基因工程二聯活載體苗。在外界環境中不能復制、增殖，不污染環境。
1.3種毒生物學特性測定1.3.1毒價滴定1.3.1.1空斑計數 種毒原液分別用MEM溶液或生理鹽水作10倍遞進稀釋，接種10-5、10-6兩個滴度。每個滴度接種3個已長成良好單層Vero細胞中方瓶，每瓶加入0.5ml，在37℃～38℃吸附60分鐘，加入MEM營養液，繼續培養5～7天，進行空斑計數。計數時，用記號筆在瓶底面點數，求出同一稀釋度3瓶中平均蝕斑數，計算出每毫升種毒原液所含空斑數。對種毒及其在雞胚繼代后不同代數進行空斑(PFU)計數，結果參見1.3.4。
1.3.1.2雞胚半數感染量(EID50)滴定 取雞胚毒(收獲有痘斑的絨毛尿囊膜)按濕重用生理鹽水1∶10稀釋，研磨勻漿，置-25℃反復凍融3～5次。用生理鹽水作10-1、10-2、……等10倍系列稀釋，取其中10-3～10-84個稀釋倍數接種10～12日齡的雞絨毛尿囊膜，每胚0.2ml。每個滴度10個胚，置37℃繼續孵育，每天照蛋一次。剔除48小時內的死胎，收獲第48小時后死胎及120小時內活胚，置4℃冰箱過夜，打開雞蛋，觀察絨毛尿囊膜上的痘斑數量、大小、色澤、中心有無壞死；膜水腫情況。以出現痘斑的最大稀釋度為終點，計算EID50。
1.3.2種毒毒力及穩定性試驗
1.3.2.1角膜劃痕試驗 將樣品以滅菌生理鹽水作1000×、2000×、5000×、10000×、20000×等稀釋度，每一稀釋各劃種體重300～500g豚鼠1只，先以2％普魯卡因滴入一側眼角膜，施以局部麻醉，以角膜鑷子夾持結合膜，用手術刀在角膜上均勻地劃出3條平行刀痕，以肉眼看出痕跡，但未將角膜劃穿為度。然后自高倍稀釋度開始，分別將稀釋病毒滴液滴在角膜上，每只2滴，涂布均勻，靜置1分鐘左右，放回飼養。逐日觀察，第4天判定結果。
角膜反應判定標準+++角膜呈混濁白色，虹彩完全不見，++角膜混濁，虹彩清晰可見，+角膜輕度混濁，有2/3混濁面，±角膜有1/3以下混濁面-角膜完全透明，僅有刀痕種毒復蘇后，在雞胚連續繼代，取F1、F3、F5、F8各代毒作角膜劃痕試驗。結果見下表種毒雞胚繼毒角膜劃痕試驗結果
原痘苗病毒的毒力通常在10000×+++以上，本重組痘苗病毒毒力穩定在1000×+++左右，表明其毒力已較痘苗病毒顯著減弱。
1.3.2.2家兔皮內接種試驗將樣品用滅菌生理鹽水作10-1～10-5遞增稀釋，取1.8～3.0kg健康兔2只，背部剃毛后，每兔接種5點，每一稀釋度1點，每點0.1ml，觀察4d，判定結果。按痘苗病毒標準10-1及10-2接種部位壞死直徑不得超過10mm；10-3～10-5接種部位不得有壞死。5個稀釋度的浸潤直徑總和平均不得小于50mm，結果見下表種毒雞胚繼代毒家兔皮內接種試驗結果
-為無浸潤。
結果表明，所有稀釋度均不引起壞死。在10-1、10-2均出現直徑2～5mm的浸潤斑，5個稀釋度的浸潤直徑總和不超過14mm。以上2項試驗均表明其毒力比較原痘苗病毒已顯著減弱，且相當穩定，不因繼代而增強。
1.3.3種毒在靶動物體內消長規律測定種毒復蘇后，采雞胚毒勻漿，稀釋至一定濃度，肌肉注射3月齡新西蘭兔及1月齡仔豬，每只兔或豬的接種劑量均為4×107PFU。于接種后第2、3、5、7、11、15、20天定期撲殺2只。無菌采集各組織器官樣品，用PBS研磨制成1∶10勻漿，離心后取上清，接種9日齡雞胚絨尿膜，每個樣品接種雞胚3只。逐日照蛋，于接種后96小時內收胚，觀察記錄絨尿膜痘斑情況，并剪取接種部位絨尿膜(直徑約2cm)，加該胚絨尿液1ml研磨成勻漿后，用HBsAg ELISA試劑盒檢測HBsAg。根據痘斑和HBsAg檢測結果，綜合判定樣品中是否含有重組病毒，從而弄清重組痘苗病毒(vv-HBsAg/ss)在家兔和豬體內各組織器官中的分布情況和消長規律。為了查明接種動物的排毒相關情況，在對其分泌、排泄物進行病毒檢測的同時，我們在豬的試驗中，還設計了同居組。于同居第6天、第8天和第11天各撲殺2只，同上采樣檢測重組病毒。
1.3.3.1種毒在兔體內的分布動態重組痘苗病毒在兔體檢測結果見表1。
表1 家兔各組織器官重組痘苗病毒檢測結果
—表示未檢出病毒和HBsAg，/表示未做。
由表1可見，在接種后7天后，血液及絕大多數組織器官內均有重組病毒檢出，到第11天，肝、肺、腎仍有檢出，第15天后的所有樣品均為陰性。尿樣、腦和胸腺組織始終未檢出病毒。
重組病毒在豬體內的分布和消長情況與兔體非常相似，在第15天和20天的所有樣品中均未分離和檢出到重組病毒。
1.3.3.3豬的同居感染試驗6只受試豬的所有樣品均未檢出到重組痘苗病毒。
1.3.4種毒表達水平及其穩定性試驗本疫苗的基因工程體其表達產物為SS和HBsAg的融合蛋白(HBsAg/ss)，能組裝成病毒樣顆粒，在顆粒表面可檢出HBsAg和SS兩種抗原，HBsAg可用測HBsAg的ELISA試劑檢測。方法按試劑盒說明書進行。并用已知含量的標準品HBsAg倍比稀釋后作ELISA檢測。各稀釋之間呈良好的線性關系。用HBsAg含量為橫座標，OD450值為縱座標，作成標準曲線。其回歸曲線的公式為Y＝0.349+0.05X。
將HBsAg測定的OD450值代入回歸曲線公式，即可求得各樣品的HBsAg含量(μg/ml)。測SS目前主要用放射免疫分析(RIA)，但因檢測試劑價格昂貴，并需特定的脈沖計數器和防務設備，非常規實驗室所能做到。由于HBsAg和SS系在同一工程體上聯鎖表達，二者之比值是一定的。我們用多個樣品同時測定HBsAg和在上海第二軍醫大學用RIA測定SS含量，發現二者之比值衡定在210∶1。在本試驗中我們用HBsAg的含量按上述比值測算SS含量。
將低溫冰箱中保存的凍干種毒取出，在雞胚絨毛尿膜上連續繼代8代，收獲F1～F8各代的絨毛尿膜，按常規制苗方法勻漿后，分別作空斑滴定，進行HBsAg測定和SS測定。結果見下表激生1號疫苗空斑數表達水平和穩定性試驗結果
，平均為3.13×108，完全符合制苗標準。HBsAg的表達量亦均以F1代最低，F2次之。其余各代均穩定在較高水平，OD450最高達1.61，平均為1.47。代入回歸曲線公式求得其含量，最高為25.22μg/ml，最低為18.62μg/ml，平均22.42μg/ml。并求得SS含量，最高為120.09ng，最低88.67ng，平均106.76ng。
我們已建立用捕捉法ELISA檢測本疫苗中HBs/ss雜合顆粒中SS含量的專用方法，此法，正在進一步完善和試劑標準化及穩定性的測試。用新建的方法測定一部分疫苗中SS含量，檢測結果與上述推算結果基本符合。
1.4種毒鑒定和保存1.4.1空斑數測定1.4.2表達水平測定1.4.2.1 HBsAg含量測定 在一般成品檢驗時測HBsAg的表達水平用OD450表示即可，但在種毒鑒定時最好能測到具體表達量。參見1.3.4。
1.4.2.2 SS含量測定 通常用RIA測定，但此法不能在一般實驗室，我們按表達產物中SS與HBsAg的衡定比例測算SS含量。參見1.3.4。
1.4.3毒力測定 同1.3.2.11.4.4無菌檢驗 按常規方法進行1.4.5支原體檢驗 按常規方法進行1.4.6外源病毒檢驗 按常規方法進行1.4.7結果 種毒測定結果見表1表1種毒鑒定結果*
*本表中的ml系指雞胚絨毛尿囊膜的勻漿原液。
表1結果表明，3代毒種完全符合毒種標準，可作生產用毒種。
1.4.8凍干保存 所有被測毒均符合予定指標要求，選擇其中空斑數高，表達水平穩定者，凍干后-70℃冷凍保存，作為種毒批，生產中應用時，在雞胚復壯繼代3代后應用作為生產用種毒。
2.疫苗制造和半成品檢驗2.1生產用毒的制備2.1毒種繁殖 取冷凍保存的毒種，接種雞胚絨毛尿囊膜，無菌收膜，傳2～3代，加入保護劑，分裝小瓶中，封口，保存于-20℃低溫冰柜中，注明收獲日期、毒種代數及PFU數等。
2.2制苗材料的選擇 選發育良好的10-11日齡SPF雞胚作制苗材料。
2.3制苗用毒液的繁殖2.3.1雞胚苗的接種、收獲取生產用毒種，用滅菌生理鹽水稀釋成10-4，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，接種后封閉針孔，置35℃～37℃繼續孵育，不必翻蛋，每天照蛋2次。將48小時前死亡的雞胚棄之，取48小時后至120小時死胚及120小時活胚，每若干個胚為一組，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內結凍保存，用于制苗。
2.4半成品檢驗每組分別取樣作無菌檢查，應無細菌生長。
2.5配苗及分裝凍干2.5.1配苗 將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g膜濕重量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過。
2.5.2分裝、東干 將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行。按凍干后的空斑數確定對各種家畜接種的頭份。
2.6瓶器與包裝 按《獸醫生物制品規程》進行。
3.成品檢驗3.1物理性狀 本品為微紅色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后，迅速溶解。
3.2無菌檢驗 按《無菌檢驗規程》進行。應無菌。
3.3病原體檢驗 按《病原體檢驗法》進行。應無病原體生長。
3.4外源病毒檢驗 按《獸醫生物制品標準》進行，應無外源病毒污染。
3.5安全檢驗用18g小白鼠10只，每只皮內注射0.5ml，觀察15天。應健活。
3.6表達產物測定 每瓶疫苗加適量生理鹽水，恢復成凍干前勻漿原液容積。按1.3.4方法測定HBsAg。每ml勻漿原液OD450≥1.2，含量≥17.02μg/ml為合格。
3.7空斑計數 每批疫苗抽樣3瓶，按1.3.1.1作空斑計數。根據空斑單位確定使用頭份，牛等大動物用108PFU/頭左右，豬、羊等中動物用107PFU/頭左右。
3.8表達水平測定 按3.4.2.1和3.4.2.2法進行。
3.9剩余水分測定 按《凍干制品剩余水分測定法》進行。應符合規定。
3.10真空度測定 應符合規定。
9批疫苗成品檢驗結果見表2
表2 9批疫苗生產檢驗結果*<
>*本表中的ml數系指絨毛尿膜勻漿原液。
4.作用與用途 用于促進豬、牛、羊動物生長。
5.用法與用量 使用時按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋，肌注。
6.貯藏 在-15℃以下保存，有效期不超過2年。2～8℃保存不超過3個月。
(五)疫苗田間試驗1.免疫途徑試驗 痘苗病毒疫苗(牛痘苗)在人通常用皮膚劃種。對家畜我們也曾試用劃種，但操作困難，容易引起皮膚感染，效果也不確實。故改用多點皮內注射。我們比較了皮內注射與肌肉注2種免疫途徑的免疫增重效果。
1.1預備試驗 用三元雜交公豬35日齡斷奶6頭去勢后，分成3組，第1組皮內注射，劑量1ml/頭(1.05×107PFU)，分5點注射，第2組肌肉注射1ml/頭(1.05×107PFU)，第3組注射生理鹽水皮內注射對照。免疫后，皮內組在注射部位出現丘疹、水皰、化膿等出痘反應，第9天消退，2周后結痂脫落，局部形成白色凹陷疤痕，肌肉組和對照組均無可見反應，以后于接種后3、6、9、12、15、17周稱重，并計算飼料消耗，結果見下表免疫途徑試驗增重與飼料消耗表
1*最小二乘均數皮內組織和肌肉組日增重均顯著高于對照組，增重提高率分別為10.3％和12.1％，凈增重分別為6.6kg/頭和8.2kg/頭，飼料利用率均提高5.5％。
1.2 55～60日齡豬免疫途徑試驗取58日齡左右的架子豬23頭，分為皮內注射組，劑量8.4×107PFU/頭；大劑量肌肉注射組，劑量1.2×109PFU/頭和生理鹽水對照組，觀察、稱重4個月。結果見下表。
50～60日齡豬不同途徑免疫增重結果
結果皮內組免疫后可持續增重4個月，提高增重15.3％，凈增重7.3kg/頭，本試驗未設同樣劑量的肌肉注射組，而設了一個大劑量肌注組是個錯誤，但卻因此發現大劑量免疫不僅不能提高免疫增重效果，反而出現負增重(-5.2％)這一值得重視的現象。
1.3 85～90日齡肥豬不同途徑免疫試驗 取85～90日齡的肥育豬30頭，分成4組，第1組為皮內注射組，第2組為肌注組，劑量均為8.4×107/頭，第3組先肌肉注射后于130日齡時用大劑量(8.4×108PFU/頭)加強免疫，第4組為鹽水對照組，觀察、稱重12周，結果見下表85～90日齡豬不同途徑免疫增重結果
>結果皮內和肌肉組增重效果不相上下，分別提高8.8％和9.1％，凈增重為3.6kg/頭和3.7kg/頭，大劑量加強免疫組在加注前均高于以上2組，加強注射后至12周稱重體重時顯著落后，增重提高為6.9％，凈增重2.8kg/頭，再一次說明大劑量免疫反而抑制增重。
1.4小結 從以上3次試驗看，皮內注射和肌肉注射增重效果無顯著差異，前2次試驗提高增重率和凈增均高于第3次試驗。這主要由于觀察、稱重的時間不同，前二者均為4個月，而后者為3個月，與免疫日齡關系不大。由于皮內注射操作麻煩，且獸醫習慣用肌肉注射，因此確定以后免疫途徑一律采用肌肉注射。至于免疫日齡建議在出欄前3～4個月免疫為佳。加大免疫劑反而影響生長，這是一個重大發現是應用激素免疫調控時應該注意的。
3.安全試驗3.1家兔安全試驗 在重組痘苗病毒在動物體內消化規律研究中，我們用4×107PFU/頭的劑量(豬的1免疫劑量)給14只家兔免疫，均未見有不良反應，在最適免疫量試驗中，用108、107、106、105PFU/頭劑量，分別免疫10只家兔，亦均未見有不良反應。其中108PFU/頭已是家兔最適免疫劑量的100倍。免疫兔不排毒，不引起同居感染，說明本疫苗對家兔是十分安全的。
3.2豬的安全試驗 先后在四川地區近百個豬場和部分農戶中試用，共免疫豬20700頭，無一例出現精神異常、食欲降低等不良反應。其中有16頭豬用10倍以上劑量接種，亦無不良反應。在進行不同途徑免疫試驗中，亦曾用1.2×109PFU/頭(10頭份)和8.4×108PFU/頭(8頭份)大劑量免疫豬，亦均無不良反應，免疫豬不排毒，不引起同居感染，說明本疫苗對豬是十分安全的。
3.3牛、羊的安全試驗 在江蘇、安徽、四川、新疆等地區免疫肉牛938頭，綿羊和山羊7304頭，均無任何不良反應。表明本疫苗對牛、羊都是十分安全的。
3.4懷孕動物的安全性試驗 取健康懷孕豚鼠10只，飼養觀察1周后，接種激生1號疫苗107PFU/只(兔的10倍劑量)。觀察10天，未見有任何不良反應，也不引起流產。繼續飼養，直至各豚鼠均安全分娩，表明本疫苗對懷孕動物是安全的。
4.免疫豬屠宰試驗 在對豬85～90日齡段的免疫豬，在用本疫苗肌肉注射及皮內注射，免疫后4個月的豬及對照，各選3頭體重在84～90kg的豬進行屠宰測定，屠宰前空腹12～24h，宰后的胴右片進行膘厚、眼肌面積、胴體長、pH值、肉色等測量。其左半胴體取第3～5腰椎處背最長肌中心部分各取樣100g作肉脂化學成分的常規分析，測定水份、粗脂肪、粗蛋白等成分。
結果對照、肌注和皮內各組宰前平均活重為85.9kg、89.3kg和85.7kg、屠宰率對照為72.9％、肌肉組為73.4％、皮內組為72.4％。差異不顯著，平均膘厚分別為2.53cm、2.57cm和2.48cm、瘦肉率分別為52.9％、48.2％和52.4％，肌肉組屠宰體重大，瘦肉率低，但因個體差異大，差異不顯著，試驗豬皮、脂、骨、肉的比例均與對照相近。只是板油重和板油率，對照組為2.22kg和2.57％，而肌肉組和皮內組分別為1.70kg和1.9％，1.93kg和2.20％，均低于對照組。各組肉質的物理分析；pH值均在6.4～7.0之間，其他嫩度、大理石紋、系水力，肉色均無明顯的差異。對肉質的化學成分進行分析；對照組水分、蛋白質、粗脂肪分別占72.2％，19.4％，8.1％；肌注組分別占73.3％，19.8％，6.7％；皮主組分別占73.5％，20.3％，5.5％。各組間差異不大。屠宰測定的結果說明激生I號促進肉豬的增重并不影響豬肉的質量，它是一種安全的疫苗。
5.田間試驗和區域試驗 本疫苗至1999年已試生產疫苗5萬頭劑(豬)，發出進行田間試驗和區域試驗4萬余頭劑。經返回信息，豬20700頭，羊7304頭，牛938頭。結果表明免疫增重效果顯著，茲分別敘述于下5.1豬的田間試驗和區域試驗 豬一次免疫可持續增重3～4個月，提高增重率最低1.3％，最高51.6％，平均10％以上。每頭豬凈增重則視免疫日齡、氣候和飼料管理條件、疾病干擾以及觀察稱重時間，而有很大差異。平均在5kg/頭左右。以四川都江堰市的區域示范試驗為例，試驗在該市畜牧局下屬17個豬場進行，共參試豬677頭，其中免疫組383頭，對照組294頭。免疫后觀察、稱重99～143天，結果免疫組比對照組日增重平均提高12.15％，平均凈增重6.35kg/頭，四川省及重慶市等地區使用本疫苗后的情況見表3表3四川省及重慶市等部分地區使用生長抑素基因工程活載體疫苗情況
5.2肉牛的田間試驗和區域試驗 共免疫肉牛938頭，其中每月稱重，共返饋稱重紀錄的3個肉牛場共免疫牛49頭。對照組38頭。觀察、稱重83和116天。結果稱重至83天者提高增重44.8％和31.9％，凈增重分別為20.2kg/頭和14.4kg/頭。稱重至116天者提高增重27.8％和17.5％，凈增重為11.93kg/頭和7.27kg。如后者按95天稱重統計，則提高增重率為32.96％和28.98％。也就是說第4個月免疫增重效力顯著降低，有一個組甚至出現負增重。結果顯示牛一次免疫可持續增重3個月。如需繼續飼養，應加強免疫，但本疫苗因系活載體苗不適于再次免疫。對于生長期的大家畜和乳用家畜，如乳牛、乳羊用于促進泌乳，增加乳產量，則需研究其他激生系列疫苗，以期更上一層樓。目前對肉牛來說以在出欄前3個月時免疫為宜。
5.3羊的田間試驗和區域試驗 綿羊田間試驗返回按月稱重記錄的有A、B1、B2三個，羊群A群參試羊共63頭，免疫31頭，對照32頭，稱重3個月，結果試驗組比對照組增重提高33.6％，凈增重4.7kg，B1群參試羊60頭，免疫和對照各30頭，稱重63天，結果增重提高僅7.4％，凈增重0.67kg/頭，但如將公母羊分開計算，則母羊增重提高11％，公羊4.2％，凈增重母羊0.87kg/頭，公羊0.36kg/頭，存在明顯性別差異。B2群參試羊16頭，免疫、對照各8頭，均為不去勢公綿羊，稱重63天。結果提高增重24.9％，凈增重1.92kg/頭，3個組之間有明顯差異，這可能是由于后二者觀察稱重時間短(少1個月)有一定影響。另外對公羊去勢比不去勢的效果要好。山羊田間試驗做得較少，只有四川成都郊區麻羊的一次試驗共5個羊群，共參試羊188頭，免疫組96頭，試驗組92頭，增重率最低11.7％，最高37.4％，凈增重最低0.33kg/頭，最高1.46kg/頭，平均0.66kg/頭，其中最高的一組始重最高。這是一條重要的經驗，本疫苗給山羊的時間適當推遲更好。從免疫劑量看，其免疫量以降低至107PFU/頭為宜。
根據四川內江市對大耳綿羊的區域試驗，共參試綿羊4800頭，觀察3個月，平均提高增重22.2～34.5％，每頭凈增重2.3～3.3kg。共參試山羊1800頭。觀察3個月，平均提高增重18.9％，每頭凈增重1.5～3.0kg。
權利要求
1.用于生長抑素(SS)基因工程活載體疫苗的基因工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)，其構建方法為1、1)SS基因合成和克隆SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下123456789 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′用380型DNA自動合成儀合成A52和A23 2個兩端有酶切位點的SS基因片段A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′A23將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基因克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質粒BamHI 1 23456789 10 11 12 13 14 stop5′-GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC ATTCGAAHindIII1、2)SS基因與HBsAg融合基因的構建 從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC12-ss質粒，構建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss質粒；1、3)HBs/ss表達質粒的構建 將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質粒；1、4)帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆 將pGJP-HBs/ss轉染，經痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質粒中外源基因插入部位的兩側帶有痘苗病毒TK基因的同源序列，因同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。
2.用權利要求1所述生長抑素基因工程體制成的基因工程活載體疫苗(激生1號疫苗)，其配制方法如下2、1)雞胚苗的接種、收獲 取生產用重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒種，用滅菌生理鹽水稀釋1000-10000倍，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，置35℃～37℃繼續孵育，每天照蛋1-2次，取48小時至120小時死胚及120小時活胚，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內結凍保存，用于制苗；2.2)半成品檢驗 取樣作無菌檢查，應無細菌生長；2.3)配苗 將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過；2.4)分裝、凍干 將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行；2.5)瓶器與包裝 按《獸醫生物制品規程》進行。
全文摘要
本發明生長抑素基因工程體及其活載體疫苗,屬于生物技術高科技研究領域。將合成的SS基因連接于乙肝表面抗原(HBsAg)基因上,構建成HBs/ss融合基因。然后將其克隆到痘苗病毒表達載體(pGJP－5)中,與痘苗病毒同源重組,篩選出能表達HBsAg/ss融合蛋白的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。將此基因工程體在雞胚絨毛尿膜上增殖后,制成生長抑素基因工程活載體疫苗。經農業部審批為安全等級Ⅰ級,同意進行中間試驗。試驗結果表明,本疫苗生產工藝簡便,不造成環境污染,免疫豬、牛、羊等家畜安全有效。于1999年月12月經農業部審批。同意在川、蘇2省商品化生產(農基安審定99B－03—09)。
文檔編號C12N15/62GK1267724SQ0010729
公開日2000年9月27日 申請日期2000年5月9日 優先權日2000年5月9日
發明者杜念興, 楊宏, 吉傳義, 龔文波, 徐文忠, 王林云, 申詠紅, 黃吉風, 張益民, 楊京平, 李汝儉 申請人:南京農業大學, 中牧實業股份有限公司成都藥械廠