專利名稱：有效的多重檢測丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺損病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測生物樣本中的核酸序列、尤其是來源于感染性微生物的序列的改進方法。
全世界數(shù)百萬人感染有人免疫缺損病毒(HIV)，由此帶來嚴重的公眾健康問題。通過污染的血制品可導(dǎo)致HIV感染蔓延，這就意味需要一種能檢測出患者樣本中少量HIV RNA的篩選方法。而且，對HIV感染的改進治療的不斷增加，意味著對患者的感染進行早期檢測是極其重要的，以便開始實行適當(dāng)?shù)闹委煷胧?br>
丙型肝炎病毒(HCV)是一種非腸道傳播病毒，全世界大多數(shù)輸血后肝炎和大部分偶發(fā)性(或群體獲得的)肝炎病例都源于此。已證實全世界1％以上的人口感染有HCV。HCV感染與急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和隨后的肝細胞癌有關(guān)。
在Flaviviridae家族中，目前將HCV分類成分離屬、Hepacivirus。其基因組由含單個、大的開放讀框(ORF)、約9500核苷酸的正鏈RNA分子組成，這種開放讀框編碼約3000氨基酸的聚蛋白前體。這種大的ORF以約340個核苷酸的5’非編碼(NC)區(qū)為開端，它是基因組的極其保守區(qū)域。ORF的5’區(qū)編碼(在5’-3’方向)衣殼蛋白、兩個包膜蛋白(E1和E2)和少數(shù)未知功能的蛋白(P7)。ORF的3’部分編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括蛋白酶、蛋白酶/解旋酶雙功能蛋白、RNA聚合酶和常用肽。
全世界范圍對HCV編碼序列的分析發(fā)現(xiàn)個體病毒分離物之間存在相當(dāng)大的序列變化。而且，對單個病人的HCV序列的分析表明病毒循環(huán)成所謂的“準種”，它包含相關(guān)但不相同的序列。一般認為分離物間和單個病人中存在的變化是由于病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶的低保真性所致。HCV的基因改變程度對感染的預(yù)防、診斷和控制具有重要意義。
HCV感染的血清學(xué)診斷，典型的是通過商業(yè)上可得到的酶免疫測定法(EIA)來檢測，該方法可檢測結(jié)合有重組HCV蛋白或肽的抗體。通過重組免疫印跡測定法(RIBA)可以證實陽性EIA的結(jié)果，但是EIA或RIBA測定法都無法將現(xiàn)在的感染與過去區(qū)別開。由于循環(huán)病毒的滴度特別低，還沒有成功地找到一種直接測定病毒蛋白的方法。而且，對于暴露感染后2-3個月，基于抗體的測定法通常無法檢測出HCV感染。
因此，本技術(shù)領(lǐng)域需要一種改進的測定法，該方法能同時篩選患者樣本中的HIV和HCV。
本發(fā)明提供了用多重測定法同時檢測生物樣本中存在的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法。
因此，一方面，本發(fā)明涉及共檢測生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法。該方法包括(A)用來源于上述樣本的RNA作為模板、至少一種能引發(fā)從HCV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；(B)用一對或多對對HCV的5’非編碼區(qū)具有特異性的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV具有特性異的寡核苷酸引物對上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；其中上述每一對對HCV具有特異性的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號2>；其中每一對對HIV-1具有特異性的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(i)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(ii)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，
其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物；和(C)檢測上述擴增產(chǎn)物，其中對HCV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA，對HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIVRNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物和HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCVRNA和HIVRNA。
第二方面，本發(fā)明涉及一種共擴增丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對或多對對HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對可疑含有HCV DNA、HIV DNA、或者同時含HCV DNA與HIV DNA的DNA樣本進行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號2>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>；且其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
第三方面，本發(fā)明涉及一種共檢測生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法，該方法包括(A)用來源于上述樣本的RNA和內(nèi)部陽性對照(IPC)RNA作為模板、用至少一種引發(fā)從IPC RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物、至少一種引發(fā)從HCVRNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)IPC特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(c)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(d)任何上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的組合；(B)用一對或多對對IPC特異的寡核苷酸引物、一對或多對對HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)IPC特異性擴增產(chǎn)物，(b)IPC特異性擴增產(chǎn)物和HCV特異性擴增產(chǎn)物，(c)IPC特異性擴增產(chǎn)物和HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(d)任何上述擴增產(chǎn)物的組合；其中上述每一對對IPC特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IP-CF1)<序列號8>，和(II)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號9>；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號11>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物；和(C)檢測上述擴增產(chǎn)物，其中對IPC-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在IPC RNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCVRNA，對HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV RNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物和HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA和HIV RNA。
第四方面，本發(fā)明涉及一種共擴增內(nèi)部陽性對照(IPC)DNA、丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對或多對對IPC特異的寡核苷酸引物、一對或多對對HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對可疑含有IPC DNA、HCV DNA、HIV DNA、或者任何前面所述組合的DNA樣本進行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)IPC擴增產(chǎn)物，(b)HCV特異性擴增產(chǎn)物，(c)HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(d)包括(a)、(b)和(c)的任意組合；其中上述每一對對IPC特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號8>，和(ii)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號9>；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號11>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和
(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
其它方面，本發(fā)明使用隨機寡核苷酸引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；或者可以使用一種或多種HCV特異的和一種或多種HIV特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，如含與HCV或HIV RNA中的序列相對應(yīng)的序列的寡核苷酸。
測定擴增物的方法包括，但不限于(a)電泳和(b)在固體支持體上捕捉擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物上附有IPC-、HCV-或HIV-特異性探針，接著用比色測定法對結(jié)合產(chǎn)物進行定量測定。有用的IPC-特異性捕捉探針包括但不限于5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號17>，有用的HCV特異性捕捉探針包括但不限于5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’<序列號12>，有用的HIV-1特異性捕捉探針包括但不限于5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’<序列號13>，和有用的HIV-2特異性捕捉探針包括但不限于5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’<序列號14>。
另一方面，本發(fā)明涉及一種共檢測生物樣本中的HCV RNA和HIV RNA的試劑盒，該試劑盒包括(a)一對對HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號2>；和(b)對HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的、對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTCC AGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，以及(c)一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
還有一方面，本發(fā)明涉及一種用于共擴增DNA樣本中的HCV DNA和HIVDNA的試劑盒，它包括(a)一對對HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號2>；和(b)對HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的、對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，以及(c)一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)可以用下列多重測定法同時檢測含HCV和HIV RNA的生物樣本中的少量丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA，即(i)在來源于樣本的RNA上進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，和(ii)用含與存在于HCV和HIV RNA中的某些序列互補的序列的特殊寡核苷酸對擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此本發(fā)明提供了改進的單循環(huán)、多重逆轉(zhuǎn)錄/擴增測定法，該方法可檢測同一樣本中低復(fù)制量的HCV和HIVRNA。
根據(jù)序列保守性、分子內(nèi)和分子間的相互作用以及預(yù)測的擴增子的二級結(jié)構(gòu)和環(huán)境序列來選擇寡核苷酸引物。而且，該引物和測定方法應(yīng)該允許HCV和HIV基因組的多區(qū)域、多病毒種類和內(nèi)部陽性對照(IPC)RNA(或DNA)的共同擴增(和共同檢測)。病毒基因組的多區(qū)域的共同擴增/檢測增加了測定的敏感性，IPC的共同擴增減少了因PCR抑制而致假陰性結(jié)果的可能性。
分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和蛋白質(zhì)生物化學(xué)中的許多技術(shù)可用于實施本發(fā)明，這些在下列文章中有解釋《當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)》I、II和III卷，1997(F.M..Ausubel ed.)；Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約；《DNA克隆實驗入門》I和II卷，1985(DN.Glover ed.)；《寡核苷酸合成》1984，(M.L.Gait ed.)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》，1984(Hames和Higgins eds.)；《分子克隆的實驗指導(dǎo)》；叢書，《酶學(xué)方法》(Academic出版社)；和《蛋白質(zhì)純化原理和實驗》第二版(Springer-Verlag，N.Y.)。
本文所用的“核酸”或“聚核苷酸”是指任意長度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸或混合多核糖-多脫氧核糖核苷酸。這包括單鏈和雙鏈分子，如DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜交體，以及由堿基與氨基酸主鏈共軛形成的“蛋白質(zhì)核酸(PNA)”。這些也包括含修飾堿基的核酸。
本文所用的核酸序列的“成分”是指與起始序列參加Watson-Crick堿基配對的反義序列。
本文所用的“引物”是指長度約為5-50核苷酸的分離寡核苷酸，優(yōu)選長約6-25核苷酸，最好的優(yōu)選是長約6-18核苷酸，它與有意義的單鏈核酸序列形成雙鏈體，并通過逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶允許互補鏈聚合。
本文所用的“分離”的核酸是指從其初始環(huán)境去除的成分(例如，如果是天然產(chǎn)生的，則為天然環(huán)境；或者如果是合成的，則為反應(yīng)混合物)。分離的核酸含有約小于50％的其原始相關(guān)成分，優(yōu)選小于約75％，最好的優(yōu)選是約小于90％。
“來源于”指定的序列的核苷酸序列是指與指定序列的區(qū)域相對應(yīng)的序列。這包括與該序列同源或互補的序列。
內(nèi)部陽性對照(IPC)靶核苷酸是指克隆到成質(zhì)粒載體中的合成的核苷酸序列，該質(zhì)粒隨后被線性化，尤其是通過限制酶的作用。IPC尤其含有包圍基因探針結(jié)合區(qū)域的多引物結(jié)合序列，并作為一種對抗核苷酸擴增反應(yīng)中的假陰性結(jié)果的基因控制。
優(yōu)選的內(nèi)部陽性對照靶DNA的序列為5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<序列號15>
可以用常規(guī)方法制備含有任何本文所公開的序列或其亞序列的核苷酸。例如，DNA可以用下列方法化學(xué)合成，如Matteucci等，1981，《美國化學(xué)會雜志》(J.Am.Chem.Soc.)1033185中的亞磷酰胺固體支持體方法，Yoo等，《生物化學(xué)雜志》76417078中的方法，或者其它已知方法。也可用本技術(shù)領(lǐng)域已知的許多方法對核苷酸進行修飾。這些修飾的非限定例子包括甲基化作用、“帽結(jié)構(gòu)”、用一種類似物取代一種或多種天然產(chǎn)生的核苷酸、以及內(nèi)核苷酸修飾，如用未荷電的連鎖(如膦酸甲基酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的修飾或荷電連鎖(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾。核苷酸可以含有一個或多個額外的共價交聯(lián)部分，例如，蛋白質(zhì)(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、嵌入劑(如丫啶、補骨脂素等)、螯合劑(如金屬、放射性金屬、鐵、氧化性金屬等)以及烷化劑?！昂怂帷币辉~也包括PNA。核酸可以通過甲基或乙基磷酸三酯的形成或者烷基氨基磷酸酯連鎖而衍生。而且，本發(fā)明的核酸序列也可以用一種能直接或間接提供可檢測信號的標記進行修飾。例如標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等等。
本文所用的擴增是指一種復(fù)制核酸的重復(fù)方法。適合的擴增方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴增、核酸單堿基擴增、以及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增。
本發(fā)明提供了用于檢測生物樣本中的HCV和HIV的方法。該方法是通過以下步驟完成的(i)用包含在樣本或來源于樣本的RNA作為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(ii)擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用至少一對擴增引物，該引物含與HCV基因組內(nèi)(優(yōu)選HCV的5’編碼區(qū))的序列相對應(yīng)的序列，和至少一對含與HIV基因組內(nèi)的序列相對應(yīng)的序列的擴增引物，以產(chǎn)生HCV特異性和HIV特異性擴增產(chǎn)物；和(iii)檢測HCV特異性擴增產(chǎn)物和HIV特異性擴增產(chǎn)物。HCV特異性擴增產(chǎn)物和HIV特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明樣本中分別存在HCV和HIV RNA。
根據(jù)本發(fā)明，生物樣本是通過任意常用方法從病人身上獲得的。適合的生物樣本包括但不限于血液、血清、血漿、尿液、人乳和腦脊液。血漿優(yōu)選作為病毒RNA的來源。
以任意方法處理這種生物樣本，這些方法可使逆轉(zhuǎn)錄試劑進入樣本內(nèi)含有的RNA特別是病毒RNA中。“來源于”生物樣本的RNA是起初存在于樣本中的任何RNA，通過處理樣本可完成進入。特別是，RNA可以用本領(lǐng)域已知的任何方法從樣本中提取，如使用異硫氰酸胍、或使用商業(yè)上可得到的試劑的方法，以及如來自Gentra系統(tǒng)公司(Minneapolis MN)的PureScriptθ方法?？梢允褂萌魏翁崛》椒?，這些方法可從RNA酶、其它蛋白質(zhì)和/或可能參與逆轉(zhuǎn)錄的任何其它成分分離出RNA。
然后使用(a)隨機引物，如從Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ得到的隨機六聚體引物，和/或(b)來源于HCV RNA基因組序列的5’或3’非編碼區(qū)的引物對樣本進行逆轉(zhuǎn)錄。用常規(guī)方法實施逆轉(zhuǎn)錄，例如見于《當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)》I、II和III卷，1997(F.M..Ausubel ed.)；美國專利5,322,770；Young等，《臨床微生物雜志》31(4)882(1993)；Myers等，《生物化學(xué)》30(3)7661(1991)；或者如未決專利申請系列號＿＿，代理人案卷號為2094/0E287的案卷中所述。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，將產(chǎn)物進行擴增?？梢允褂萌魏螖U增方法，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增、或核酸單堿基擴增。優(yōu)選使用PCR。特別是，含PCR的所有必需成分的反應(yīng)混合物是直接加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物中的。然后采用對所用引物對有特異性的條件進行擴增。
本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)某些HCV特異性和HIV特異性擴增引物對可以同時用以檢測病人樣本中低水平的HCV和HIV RNA。可用于實施本發(fā)明的引物的非限定實例包括下表1所列出的。
(s)＝有義鏈；(as)＝反義鏈擴增后，可以用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測擴增產(chǎn)物，這些方法包括但不限于瓊脂糖凝膠電泳或丙烯酰胺凝膠電泳；非同位素比色測定如SureCellθ系統(tǒng)，它可以從Ortho Clinical Diagnostic，Rochester，NY獲得(參見下面實施例1)；Eci測定；化學(xué)發(fā)光和熒光。
病毒特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明樣本中存在病毒RNA。當(dāng)使用凝膠電泳時，病毒特異性擴增產(chǎn)物是根據(jù)其大小來確定的，正如通過在含與反應(yīng)中所用的擴增引物相對應(yīng)的序列的各自病毒RNA中的定位所預(yù)測的。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了其在診斷病人的HIV和HCV感染中的應(yīng)用；在檢測抗病毒治療方案的效能中的應(yīng)用；和在篩選用于HCV感染和HIV感染的樣本的供血中的應(yīng)用。
下面的實施例是舉例說明本發(fā)明，而不是進行限定。實施例1生物樣本中的HCV和HIV的多重檢測進行下面的實驗是為了根據(jù)本發(fā)明的方法來檢測HCV和HIV的多重測定的敏感性。A.方法1.患者樣本使用制造廠商的指導(dǎo)中的RocheAmplicor測定法對加樣在HIV陽性患者血漿和HCV陽性患者血漿中的病毒進行定量測定。首先將含HIV和含HCV的血漿樣本分別稀釋至含1,000copies/ml和10,000copies/ml。然后按如下結(jié)合將50l HCV和500l HIV血漿加入450l陰性血漿中，以產(chǎn)生25個病毒基因組RNA/PCR反應(yīng)復(fù)制。將10l HCV和100l HIV血漿加入890l陰性血漿中，以產(chǎn)生5個拷貝/PCR反應(yīng)。
2.樣本制備用PureScriptθRNA分離試劑(Gentra Systems，Minneapolis MN)從血漿樣本中制備RNA。根據(jù)制造廠商的方案對體液的修飾包括使用40g、而不是20g糖元作為載體以有助于病毒RNA的沉淀。另外，在大多數(shù)情況下，RNA的異丙醇沉淀后，用乙醇洗滌RNA粒狀沉淀，將粒狀沉淀再懸浮在RT緩沖混合液中，而不是懸浮在廠商提供的RNA水合溶液中。
3.逆轉(zhuǎn)錄通過在含50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMDTT、0.4mM每個dNTP(Pharmacia Biotech)、4M隨機六聚體((PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)或特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、和焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中的20單位RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑(Promega，Madison，Wisconsin)的50l溶液中加入100U重組Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland)，來催化從RNA到cDNA的合成。在42EC培養(yǎng)30分鐘后，在100EC進行5分鐘RT反應(yīng)以去除RT活性。使每一反應(yīng)冷卻1分鐘后，以16000×g微量離心4秒。
4.PCR擴增在含25mM Tris-HCl、3mM MgCl2、0.725mM EDTA、54mM KCl、3.72mM NaCl、40M DTT、108g/mL明膠(IV型)、9.5％甘油、0.02％吐溫20、0.02％NP40、小牛胸腺DNA(2g)、1.2mM每個dNTP、0.4M每個引物、10個拷貝線性化內(nèi)部陽性對照(IPC)質(zhì)粒DNA、和16 U標記(Tag)聚合酶的100l溶液中、在PE9600熱循環(huán)器(Perkin-Elmer)中進行PCR。將Tag、TP1-12和TP4-9的單克隆抗體(其制備公開在美國專利5,338,671中)，分別以50∶1和5∶1摩爾比例加入反應(yīng)中，以提供Tag聚合酶的55∶1摩爾比例的抗體。在96EC進行3分鐘初始變性作用后，在96EC和68EC分別進行5秒和40秒的40個循環(huán)擴增。循環(huán)結(jié)束時，在103EC進行5分鐘后加熱步驟，以使Tag聚合酶失活。
5.PCR產(chǎn)物的檢測通過4％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，之后進行溴化乙錠染色?；蛘?，在擴增期間用5’-生物素標記的引物(有義鏈)使PCR產(chǎn)物生物素化。通過對與乳汁顆粒共價結(jié)合的寡核苷酸探針進行雜交以捕捉產(chǎn)物，它沉積在流通膜的表面(SureCellθ測定HCV-1探針是5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>和5’-GAACAGATAAACACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>；HIV-2探針是5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>；和HCV探針是5’-CTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成)。探針/產(chǎn)物復(fù)合體與鏈霉親和素(SA)-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物反應(yīng)，它催化染料前體向染料(藍色)的氧化轉(zhuǎn)化。通過將顏色強度與標準色比較，對藍色強度進行目視計分(0-10)。所有目視顏色計分＞3則認為是陽性結(jié)果。B.結(jié)果凝膠電泳出現(xiàn)下列擴增產(chǎn)物188nt(HCV)、160nt(IPC)，和150nt(HIVLTR-長產(chǎn)物)。在每個PCR檢測25拷貝的檢測(500病毒顆粒/ml血漿)時，HIV和HCV的結(jié)合測定可以檢測所有結(jié)合的HIV和HCV樣本。另外，在5拷貝/PCR檢測(100病毒顆粒/ml血漿)下，檢測了50-90％的結(jié)合陽性樣本。結(jié)果如下表。
上述的所有專利、申請、論文、出版物和實驗方法均在此引作參考。
根據(jù)詳細的說明書本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行許多變通。這些顯而易見的變通應(yīng)在附加的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種共檢測生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法，該方法包括(A)用來源于上述樣本的RNA作為模板、并用至少一種引發(fā)從HCV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；(B)用一對或多對對HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(c)(a)和(b)的組合；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號2>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物；和(C)檢測上述擴增產(chǎn)物；其中對HCV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA，對HTV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV RNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物和HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA和HIVRNA。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用隨機寡核苷酸引物進行的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用一種或多種具有與HCV RNA的序列相對應(yīng)的序列的寡核苷酸引物和一種或多種具有與HIVRNA的序列相對應(yīng)的序列的寡核苷酸引物進行的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的擴增是通過一種選自下列的方法進行的聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴增、核酸單堿基擴增和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的檢測包括用凝膠電泳使所述的擴增產(chǎn)物顯色。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的檢測包括在固體支持體上捕捉上述擴增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(B)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(c)(a)和(b)的組合；并用比色測定法對上述捕捉產(chǎn)物進行定量檢測。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的樣本是選自血液、血清、血漿、尿液、唾液和腦脊液。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的共檢測是同時進行的。
10.一種共擴增丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對或多對對HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對可疑含有HCV DNA、HIV DNA、或者同時含HCV DNA與HIV DNA的DNA樣本進行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(c)(a)和(b)的組合；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號2>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>；且其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，還進一步包括(B)檢測上述擴增產(chǎn)物，其中對HCV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA，對HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV DNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物和HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA和HIVDNA。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的檢測包括用凝膠電泳使所述的擴增產(chǎn)物顯色。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的檢測包括在固體支持體上捕捉上述擴增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(b)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(c)(a)和(b)的組合；并用比色測定法對上述捕捉產(chǎn)物進行定量檢測。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的共擴增是同時進行的。
16.一種共檢測生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法，該方法包括(A)用來源于上述樣本的RNA和內(nèi)部陽性對照(IPC)RNA作為模板、用至少一種引發(fā)從IPC RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物、至少一種引發(fā)從HCVRNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)IPC特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(c)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(d)任何上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的組合；(B)用一對或多對對IPC特異的寡核苷酸引物、一對或多對對HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)IPC特異性擴增產(chǎn)物，(b)IPC特異性擴增產(chǎn)物和HCV特異性擴增產(chǎn)物，(c)IPC特異性擴增產(chǎn)物和HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(d)任何上述擴增產(chǎn)物的組合；其中上述每一對對IPC特異的寡核苷酸引物包括(1)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號8>，和(2)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號9>；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號11>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物；和(C)檢測上述擴增產(chǎn)物；其中對IPC-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在IPC RNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA，對HTV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV RNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物和HTV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA和HIV RNA。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用隨機寡核苷酸引物進行的。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用一種或多種具有與IPC RNA的序列相對應(yīng)的序列的寡核苷酸引物、一種或多種具有與HCVRNA的序列相對應(yīng)的序列的寡核苷酸引物和一種或多種具有與HIV RNA的序列相對應(yīng)的序列的寡核苷酸引物進行的。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的擴增是通過一種選自下列的方法進行的聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的檢測包括用凝膠電泳使所述的擴增產(chǎn)物顯色。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的檢測包括在固體支持體上捕捉上述擴增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種IPC特異性寡核苷酸探針，(b)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(c)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(d)包括(a)、(b)和(c)的任意組合；并用比色測定法對上述捕捉產(chǎn)物進行定量檢測。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>，和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>。
23.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的樣本是選自血液、血清、血漿、尿液、唾液和腦脊液。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的共檢測是同時進行的。
25.一種共擴增內(nèi)部陽性對照(IPC)DNA、丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對或多對對IPC特異的寡核苷酸引物、一對或多對對HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對或多對對HIV特異的寡核苷酸引物對含IPC DNA的DNA樣本、可疑含有HCV DNA、HIV DNA、或者任何全面所述的組合的DNA樣本進行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物包括(a)IPC擴增產(chǎn)物，(b)IPC擴增產(chǎn)物和HCV特異性擴增產(chǎn)物，(c)IPC擴增產(chǎn)物和HIV特異性擴增產(chǎn)物，或(d)包括(a)、(b)和(c)的任意組合；其中上述每一對對IPC特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號8>，和(ii)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號9>；其中上述每一對對HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號11>；其中每一對對HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，其中每一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
26.如權(quán)利要求10所述的方法，還包括(B)檢測上述擴增產(chǎn)物，其中對IPC-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在IPC DNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA，對HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV DNA，對HCV-特異性擴增產(chǎn)物和HIV-特異性擴增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA和HIV DNA。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的檢測包括用凝膠電泳使所述的擴增產(chǎn)物顯色。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的檢測包括在固體支持體上捕捉上述擴增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種IPC特異性寡核苷酸探針，(b)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(c)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(d)全面所述的任意組合；并用比色測定法對上述捕捉產(chǎn)物進行定量檢測。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的共擴增是同時進行的。
31.一種共檢測生物樣本中的HCV RNA和HIV RNA的試劑盒，該試劑盒包括(a)一對對HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號11>；和(b)對HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的、對HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，以及一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，還包括一對對IPC特異的寡核苷酸引物，其中所述的對IPC特異的寡核苷酸引物對包括正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號8>，和反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號9>。
33.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，還包括一個或多個探針。
34.如權(quán)利要求32所述的試劑盒，還包括一個或多個探針。
35.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述的探針選自由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>、5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>、5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>和5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>組成的組。
36.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成，所述的HIV特異性探針是選自以下組成的組(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<14>。
37.一種用于共擴增DNA樣本中的HCV DNA和HIV DNA的試劑盒，它包括(a)一對對HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號11>；和(b)對HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號3>，和選自下列的、對HIV-1特異的反向引物(1) 5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號5>，以及一對對HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號6>的正向引物，和對HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號7>的反向引物。
38.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，還包括一對對IPC特異的寡核苷酸引物，其中所述的對IPC特異的寡核苷酸引物對包括正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號8>，和反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號9>。
39.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，還包括一個或多個探針。
40.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，還包括一個或多個探針。
41.如權(quán)利要求39所述的試劑盒，其中所述的探針選自由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>、5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>、5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>和5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>組成的組。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’(IPCIP)<序列號17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號12>組成，所述的HIV特異性探針是選自以下組成的組(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號14>。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于同時檢測人生物樣本中的丙型肝炎病毒和人免疫缺損病毒的方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/70GK1268575SQ00104630
公開日2000年10月4日 申請日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月3日
發(fā)明者K·M·戈曼, D·R·帕特森, J·M·林南, K·宋 申請人:奧索臨床診斷有限公司