一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于細胞玻璃化冷凍技術領域，特別涉及一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體。
【背景技術】
[0002]1985年，Rall等發明了胚胎玻璃化冷凍保存方法，使得卵母細胞和胚胎的超低溫冷凍不再需要借助冷凍儀，程序得到極大地簡化。后經許多研究者的改進，目前卵母細胞/胚胎的玻璃化冷凍方法僅需I分鐘左右即可完成一個操作。如今常用的冷凍方法主要有以下幾種:冷凍條(Cryotop)法、尼龍環玻璃化(Cryoloop)法、冷凍鉤(Cryolock)法、開放拉伸細管(OPS，Open-Pul led-Straw)法等。
[0003]冷凍條(Cryotop)法于2000年由Kuwayama和Kato發明，它主要是由一個0.4mm寬、
0.1mm厚、20_長的細長形聚丙烯條和一個較硬的塑料柄組成，同時為避免貯存時對聚丙烯條造成機械損傷，在其上套一個長約3cm的塑料套管。在玻璃化冷凍時，胚胎或卵母細胞連帶0.1yL的冷凍液借助于虹吸作用被吸入聚丙烯條頂部，然后將塑料細管套上，直接投入液氮保存。解凍時，在液氮內將塑料細管取下，然后將聚丙烯條直接插入解凍液里進行解凍。但是為了降低凍存過程中對細胞的傷害，聚丙烯條的降溫速度還需要進一步改進。
[0004]尼龍環玻璃化(Cryoloop)法首先由Lane等在1999年提出，該方法將卵母細胞或胚胎在低濃度冷凍液中處理，然后將卵母細胞或胚胎移到附有玻璃化液的尼龍環上，最后將尼龍環投入浸在液氮中的冷凍管內，具有降溫速度快、冷凍損傷小的優點。但該方法使得細胞在儲存過程中與液氮長時間接觸增加了污染的風險，且需要特殊的冷凍管固定裝置進行操縱。
【實用新型內容】
[0005]本實用新型針對現有技術中的缺點，提供了一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體。
[0006]為了實現上述目的，本實用新型采取的技術方案如下:
[0007]—種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體，包括尼龍環1、金屬桿2、塑料手柄3和塑料套管4;其中，尼龍環1、金屬桿2和塑料手柄3依次固定連接，塑料套管4套在塑料手柄3靠近金屬桿2的一端。
[0008]所述尼龍環I的直徑為20um，寬為0.5-0.7臟。
[0009]本實用新型的優點為:
[0010]I)易于操作，便于儲存。該玻璃化載體克服了傳統尼龍環載體在冷凍過程中必須使用特殊的長柄螺栓將帶有尼龍環的蓋子固定到凍存管中的缺陷。同時可在塑料手柄4處對卵母細胞/胚胎的來源、類別、數量加以標識，便于長期貯存。
[0011 ] 2)冷凍速度更快，效率更高。該玻璃化冷凍載體粘附極少的冷凍液，降低了操作過程中冷凍液對卵母細胞/胚胎的毒性，卵母細胞/胚胎可直接與液氮接觸，提高了降溫速率，減小了卵母細胞/胚胎的冷凍損傷。
[0012]3)成本低，適應性好。制作該玻璃化冷凍載體的材料為普通商品化的尼龍環和塑料細管，材料來源廣泛，規格多樣。另外在操作過程中可根據不同物種(人、小鼠、大鼠、豬、牛、羊等)和細胞類型(卵母細胞、胚胎、組織塊)選擇不同規格的尼龍環I，保證了實驗效率和應用范圍。
【附圖說明】
[0013]圖1為一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體示意圖。
[0014]圖2為一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體打開示意圖。
【具體實施方式】
[0015]本實用新型提供了一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體，下面結合附圖和實施例對本實用新型作進一步描述。
[0016]圖1所示為一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體示意圖。所述卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體包括尼龍環1、金屬桿2、塑料手柄3和塑料套管4;其中，尼龍環1、金屬桿2和塑料手柄3依次固定連接，塑料套管4套在塑料手柄3靠近金屬桿2的一端。其中尼龍環I的直徑為20um，寬為 0.5-0.7mm。
[0017]實施例
[0018]圖2所示為一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體打開示意圖。該玻璃化冷凍載體的具體使用方法包括如下步驟:
[0019]I )EFS30玻璃化冷凍保存液、冷凍預處理液及解凍液的配置。
[0020]①EFS30玻璃化冷凍保存液的配置:以乙二醇(Ethyleneglycol:EG)為主體抗凍保護劑，加入聚蔗糖(Ficoll)和蔗糖(Sucrose)制成EFS30玻璃化冷凍保存液。
[0021]②冷凍預處理液的配置:按體積比(v/v)將乙二醇溶液稀釋成濃度為10%的乙二醇溶液，作為預處理液。
[0022]③解凍液的配置:以PBS為基礎液配制成0.5M的蔗糖溶液，作為解凍液。
[0023]2)冷凍
[0024]在室溫條件下，將卵母細胞/胚胎移入冷凍預處理液中平衡30秒，然后移入到EFS30玻璃化冷凍保存液中25秒，此時反復吹吸卵母細胞/胚胎，以促使冷凍預處理液和EFS30玻璃化冷凍保存液充分滲入到卵母細胞/胚胎內部；隨后將含有卵母細胞/胚胎的玻璃化小液滴移到尼龍環I上，然后投放到液氮中，并在液氮中將塑料套管4套在塑料手柄3靠近金屬桿2的一端，使其密閉凍存。
[0025](3)解凍:將玻璃化冷凍載體從液氮中取出后，拔掉塑料套管4，將尼龍環I端直接浸入解凍液中，將回收后的卵母細胞/胚胎移入新鮮的蔗糖滴中平衡5分鐘后，再移入操作液中備用。
[0026]用該裝置對357枚MΠ期小鼠卵母細胞進行玻璃化冷凍保存，回收341枚，回收率95.5% (341/357);可用329枚，可用率96.5% (329/341 )，解凍后對130枚卵母細胞進行孤雌激活，卵裂108枚，卵裂率83.0 % (108/130)，獲囊胚63枚，囊胚率48.5 % (63/130)。與同批次新鮮對照組相比，卵裂率(82.4%，56/68)和囊胚率(47.1%，32/68)均差異不顯著，說明該玻璃化冷凍載體的性能優異。
【主權項】
1.一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體，其特征在于，該玻璃化冷凍載體包括尼龍環(I)、金屬桿(2)、塑料手柄(3)和塑料套管(4);其中，尼龍環(I)、金屬桿(2)和塑料手柄(3)依次固定連接，塑料套管(4)套在塑料手柄(3)靠近金屬桿(2)的一端;所述尼龍環(I)的直徑為 20um，寬為 0.5-0.7mm0
【專利摘要】本實用新型公開了屬于細胞玻璃化冷凍技術領域的一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍載體。該玻璃化冷凍載體包括尼龍環、金屬桿、塑料手柄和塑料套管；其中，尼龍環、金屬桿和塑料手柄依次固定連接，塑料套管套在塑料手柄靠近金屬桿的一端。該玻璃化冷凍載體較傳統的尼龍環載體更易于操作和標記，而且冷凍速度快、效率高，減少了冷凍過程對細胞的冷凍損傷，同時制作成本低，適應性好。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN205196832
【申請號】CN201520890737
【發明人】傅祥偉, 朱士恩, 田見暉, 侯云鵬
【申請人】中國農業大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年11月9日