一種由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法
【專利摘要】本發明涉及一種由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，屬于植物生物技術領域。本發明以貴州地方品種頂壇花椒的未成熟果實為外植體，通過不同濃度的細胞分裂素和生長素組合誘導產生珠心胚和胚狀體，并對珠心胚再生培養過程進行了研究，建立了頂壇花椒離體再生體系，為花椒種質資源的有效利用、脫毒保存、生物技術改良等提供理論依據和技術支持。
【專利說明】
一種由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及花椒組織培養的快繁方法，屬于植物生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 頂壇花椒(Zanthoxylum planispinum var.dintanensis)是蕓香科(Rutaceae)花 椒屬（Zanthoxylum)竹葉椒（Zanthoxylum planispinum)的1個變種，分布于貴州北盤江花 江峽谷喀斯特山地或路旁，歷來以"香味濃，麻味重，產量高"而著稱，迄今已有數百年的栽 培歷史。當頂壇花椒樹齡處于5~9年時，生殖力達到峰值，要想獲得較大的經濟效益，應及 時砍伐老齡化個體，同時補植相應的幼株。頂壇花椒目前的繁殖方式主要是種子脫脂育苗， 由于其種殼堅硬，富含油脂，不透水，發芽較為困難，一粒種子最多產生一顆小苗。關于花椒 屬植物的組織培養國內外均有報道，但主要是以嫩莖、葉片為外植體，很少以花椒種子為外 植體進行組織培養，而且對于頂壇花椒組培再生研究較少。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是頂壇花椒珠心胚誘導脫毒苗的方法，本研究通過建 立頂壇花椒離體再生體系，為花椒種質資源的有效利用、脫毒保存、生物技術改良等提供理 論依據和技術支持。
[0004] 本發明所要解決的技術問題是通過以下方案來實現的：
[0005] -種由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)取頂壇花椒綠色果實內的珠心組織進行離體培養；
[0007] (2)MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.4mg/L+3%蔗糖+0.4%Gelzan為誘導培養基，誘導 珠心組織產生珠心胚；
[0008] (3)珠心胚繼代培養，得到胚狀體，繼代培養基為MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.4mg/ L+3% 鹿糖+0 · 4%Gelzan;
[0009] (4)將胚狀體于WPM+0.5mg/L 6-BA+O.lmg/L IBA的分化培養基進行培養，形成叢 生芽；
[0010] (5)將小芽切下轉接到生根培養基l/2WPM+0.2mg/L IBA上培養并從主根上萌發側 根，葉片青綠色；
[0011] (6)生根后的頂壇花椒進行煉苗移栽。
[0012] 所述綠色果實為成熟前7 -10天的果實。
[0013] 所述珠心組織取出前需要對綠色果實進行消毒，所述消毒步驟包括:在無菌條件 下用75%醫用酒精浸泡殺菌1〇111；[11，無菌水沖洗一遍，用0.1%升萊滅菌301]1；[11，最后用無菌 水沖洗4~5次，吸水紙吸干表面水分。
[0014] 所述步驟(2)(3)(4)(5)的培養條件均為溫度25±1°(：、光照強度1500~2000以、光 周期 16h/8h。
[0015] 所述步驟(2)的培養時長12 - 15天，所述步驟(3)的培養時長為25 - 35天。
[0016] 所述步驟(5)的培養時長為40 - 50天。
[0017]所述步驟(6)的生根苗為主根長達5cm，且側根有4~5條。
[0018]所述步驟(6)中的生根苗移栽前在自然光下適應3 - 5天，取出冼凈基部培養基再 移栽。
[0019]所述步驟(6)中移栽基質為珍珠巖:菜園土 = 1:3。
[0020] 所述步驟(6)中移栽后的生根苗加蓋保鮮膜。
[0021] 本發明的方法:7月中上旬采集接近成熟的果實為外植體，要求是果實表面光滑、 無明顯病斑、綠色果皮，在無菌條件下用75 %醫用酒精浸泡殺菌lOmin，無菌水沖洗一遍，用 0.1% (w/v，含有tween_§〇?_)升萊滅菌30min，最后用無菌水沖洗4~5次，吸水紙吸干表面水 分。用槍狀鑷夾住消毒后的種子，23 #手術刀切取珠心組織進行離體培養。以MS+3%蔗糖(w/ v) +0.4 % Ge 1 zan (w/v)為基本培養基，pH5.8。添加細胞分裂素6-BA 2. Omg/L和生長素2，4-D 0.4mg/L誘導珠心組織產生誅心胚，培養條件為溫度(25±1)°C、光照強度1500~20001x、光 周期16h/8h，15天左右出現明顯的珠心胚。珠心組織培養產生的珠心胚繼代培養一次，1個 月左右產生大量的胚狀體。然后轉接到WPM+0.5mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA的分化培養基進行 培養，形成叢生芽。將小芽切下轉接到生根培養基（l/2WPM+0.2mg/L IBA)上培養45d左右， 從主根上萌發側根，主根長達5cm，形成側根4~5條，葉片青綠色。生根試管苗在自然光下適 應4d，取出冼凈基部培養基，移栽至基質為珍珠巖:菜園土=1:3的花盆中，加蓋保鮮膜、保 持濕度，保證較高的移栽成活率。
[0022] 本發明方法用材少，外植體獲取方便，果實消毒后切取珠心組織培養成活率高，無 褐變、無污染。珠心胚誘導胚狀體產生叢生芽，再生繁殖系數高。
【附圖說明】
[0023] 圖1頂壇花椒接近成熟但尚未成熟的果實，
[0024]圖2珠心胚的誘導培養，
[0025]圖3胚狀體的誘導培養，
[0026] 圖4叢生芽的誘導，
[0027]圖5生根培養，
[0028]圖6移栽成活的花椒植株。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明。
[0030] 以從貞豐縣興北鎮引種到貴州省農業生物工程重點實驗室轉基因植物試驗示范 基地的8年生頂壇花椒雌株為材料。
[0031] 7月12日采集大小接近成熟、表面光滑、無明顯病斑、綠色果皮的未成熟果實見圖1 為外植體，在無菌條件下用75%醫用酒精浸泡殺菌lOmin，無菌水沖洗一遍，用0.1% (w/v， 含有tWeen80? )升汞滅菌30min，然后用無菌水沖洗4~5次，吸水紙吸干表面水分。用槍狀鑷 夾住消毒后的種子，23#手術刀切取珠心組織培養。
[0032] 以MS+6-BA 2.0mg/L+2,4_D 0.4mg/L+3%鹿糖(w/v)+0.4%Gelzan(w/v)、pH5.8為 初始培養基誘導珠心組織見圖2，培養條件為溫度(25 ± 1) °C、光照強度1500~2000lx、光周 期16h/8h，15天左右出現明顯的珠心胚。
[0033]珠心組織培養產生的珠心胚繼代培養一次，1個月左右產生大量的胚狀體。見圖3 [0034] 然后將得到的胚狀體轉接到WPM+0.5mg/L 6-BA+O.lmg/L IBA+3%蔗糖(w/v) + 0.4%Gelzan(W/V)分化培養基上進行培養，胚狀體形成叢生芽。見圖4 [0035] 將3cm高的小芽切下轉接到生根培養基（l/2WPM+0.2mg/L IBA)上培養45d左右，從 主根上萌發側根，主根長達5cm，形成側根4~5條，葉片青綠色。見圖5
[0036] 生根試管苗在自然光下適應4d，取出冼凈基部培養基，移栽至基質為珍珠巖:菜園 土 = 1:3的花盆中，加蓋保鮮膜、保持濕度。見圖6。
[0037] 本發明方法用材少，外植體獲取方便，果實消毒后切取珠心組織培養成活率高，無 褐變、無污染。珠心胚誘導胚狀體產生叢生芽，再生繁殖系數高。
[0038] 表1不同6-BA和2,4-D對頂壇花椒珠心胚誘導率的影響(n = 20)
[0039]
【主權項】
1. 一種由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，包括如下步驟： (1) 取頂壇花椒綠色果實內的珠心組織進行離體培養； (2) MS+6_BA 2·Omg/L+2，4_D 0·4mg/L+3%鹿糖+0·4%Gelzan為誘導培養基，誘導珠心 組織產生珠心胚； (3) 珠心胚繼代培養，得到胚狀體，繼代培養基為MS+6-BA 2 · Omg/L+2，4-D 0 · 4mg/L+ 3%||^j|+0.4%Gelzan; (4) 將胚狀體于WPM+0.5mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA的分化培養基進行培養，形成叢生芽； (5) 將小芽切下轉接到生根培養基l/2WPM+0.2mg/L IBA上培養并從主根上萌發側根， 葉片青綠色； (6) 生根后的頂壇花椒進行煉苗移栽。2. 根據權利要求1所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述綠色果實為成 熟前7 -10天的果實。3. 根據權利要求1所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述珠心組織取出 前需要對綠色果實進行消毒，所述消毒步驟包括:在無菌條件下用75%醫用酒精浸泡殺菌 lOmin，無菌水沖洗一遍，用0.1%升萊滅菌30min，最后用無菌水沖洗4~5次，吸水紙吸干表 面水分。4. 根據權利要求1所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(2)(3)(4) (5)的培養條件為溫度25±1°C、光照強度1500~20001x、光周期16h/8h。5. 根據權利要求4所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(2)培養時 間12 - 15天，所述步驟(3)的培養時長為25 - 35天。6. 根據權利要求4所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(5)的培養 時長為40 - 50天。7. 根據權利要求6所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)的生根 苗為主根長達5cm，且側根有4~5條。8. 根據權利要求7所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)中的生 根苗移栽前在自然光下適應3 - 5天，取出冼凈基部培養基再移栽。9. 根據權利要求8所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)中移栽 基質為珍珠巖:菜園土 = 1: 3。10. 根據權利要求9所述的由珠心胚誘導頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)中移 栽后的生根苗加蓋保鮮膜。
【文檔編號】A01H4/00GK106069779SQ201610613782
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月30日 公開號201610613782.5, CN 106069779 A, CN 106069779A, CN 201610613782, CN-A-106069779, CN106069779 A, CN106069779A, CN201610613782, CN201610613782.5
【發明人】趙德剛, 李建容, 曾曉芳
【申請人】貴州大學