一種改良的Celsior供心保存液及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種改良的Celsior供心保存液、制備方法及應用，所述器官保存液的組分為氯化鉀；氯化鎂；氯化鈣；甘露醇；組氨酸；還原型谷胱甘肽；谷氨酸鈉；乳糖酸鈉；利拉利汀；余量雙蒸水。制備方法為將雙蒸水加入容器中，再依次加入氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣，攪拌至顏色變清晰；再加入甘露醇、組氨酸、還原型谷胱甘肽、谷氨酸鈉，攪拌至顏色變清晰；然后加入乳糖酸鈉，攪拌至顏色變清晰；調節溶液的PH值和滲透壓值，雙蒸水定容，放置4℃低溫保存。本發明的優點：具有良好較長時間器官保存效果；促進供心復灌后心功能的恢復。
【專利說明】
一種改良的Ce I s i or供心保存液及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及器官保存液領域，具體的說，是一種改良的Celsior供心保存液及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 心臟移植作為終末期心臟疾病的有效治療方法已被廣泛接受。目前，低溫保存是 臨床運輸供心過程中最主要的措施，但有效保存時間較少超過6小時，這為遠程供心獲取造 成了困難，且供心在低溫保存后再灌注時心功能的恢復也效率低下。故探索有效的保存液， 以延長單純低溫保存時限、減輕供心再灌注損傷、促進長時間缺血后供心心功能的恢復是 心臟移植成功的關鍵。
[0003] Celsior液是一種高鈉、低鉀、低粘滯度的細胞外液型保存液，易于均勻擴散至組 織間隙，提高灌注效果，利于短時間內使供心降溫。組分中的甘露醇和乳糖酸鹽是大分子物 質，作為防滲透劑，阻止細胞水腫和間質水腫，平衡細胞內外和血管內外的水。還原型谷胱 甘肽、組氨酸及甘露醇，可清除羥自由基，防止氧自由基介導的內皮細胞損傷。組氨酸/乳糖 酸緩沖系統，可預防細胞內中毒并促進能量再生。鈉和鎂離子可限制鈣內流，阻止心肌細胞 內"鈣超載"。鈣超載可激活膜磷脂酶A 2,引起細胞受損。但微量的鈣離子也可避免"鈣反常" 現象。所謂的"鈣反常"是指無鈣灌注液停跳心臟后，再灌注后反而出現細胞內鈣積聚，過多 的鈣使心肌處于強直收縮狀態的現象。低鉀即可使供心快速停搏，又可限制電壓依賴依賴 性鈣通道的開放，減輕缺血導致的內皮和細胞損傷。但單純Celsior液未能使供心保存超過 6小時。
[0004] 利拉利汀（linagliptin)是一種二肽基肽酶IV(ipeptidyl-peptidase 4 inhibitor，DPP-4)抑制劑，因能通過抑制DPP-4對體內腸促胰島素胰高血糖素樣肽 (glucagon-likepeptide-l，GLP_1)和糖依賴性膜島素釋放肽（gastrie inhibitory p〇lypeptide，GIP)等多種激素的降解，促進胰島素分泌降低血糖，在臨床上主要用于治療2 型糖尿病。近期研究發現，它還能發揮除降糖作用之外的心血管保護作用。利拉利汀可通過 激活蛋白激酶A等途徑來激活心臟保護性激酶，從而減小心肌梗死面積;通過誘導心肌梗死 后心臟保護基因及相關蛋白表達增加、穩定心臟缺血時的電生理狀態、減弱缺血時心律失 常的易感性、改善缺血再灌注時心肌細胞線粒體障礙來介導心肌保護作用。同時可增加 GLP-1水平，GLP-1與其受體結合激活細胞存活信號通路，改善心肌梗死后的左室重構。心肌 梗死后重組人基質細胞衍生因子-la(CXCL12/SDF_la)水平表達升高，它是吸引干細胞至心 臟損傷處的重要趨化因子，通過與CXCR4結合介導一系列心肌再生及修復過程。利拉利汀可 通過抑制DPP-4,增加對SDF-la的降解，促進心肌再生;也可直接作用于心臟活性肽，通過非 GLP-1依賴途徑調節腦鈉肽、神經肽Y、SDF-la的活性。各種研究提示，利拉利汀可通過GLP-1 或非GLP-1途徑發揮對心臟的保護作用。但現有技術中，利拉利汀僅能作為臨床醫療用途， 其在脫離人體的研究或實驗中的保護作用及機制尚不明確。
【發明內容】
[0005] 本發明首先要解決的技術問題是提供一種改良的Celsior供心保存液，以期獲得 延長供心保存時間、促進供心復灌后心功能的恢復的效果。
[0006] 本發明解決上述技術問題是通過以下技術方案實現的： 一種改良的Celsior供心保存液，其特征在于，在1000ml保存液中，組分分別為： 氯化鉀1.12g;氯化鎂2.64g;氯化鈣0.0 lg; 甘露醇10.93g;組氨酸4.66g;谷氨酸鈉3.74g;乳糖酸鈉6.90ml; 還原型谷胱甘肽0 · 92g;利拉利汀1 · 18 X 10-7~3 · 54 X 10-7g; 余量為雙蒸水。
[0007] 本發明還提供一種上述改良的Celsior供心保存液的制備方法，包含具體步驟如 下： 按照1000ml配置量的具體步驟為， (1) 將800ml雙蒸水加入大于1000ml容器中，再依次加入氯化鉀1.12g、氯化鎂2.64g、氯 化鈣0. 〇lg，攪拌至顏色變清晰;再加入甘露醇10.93g、組氨酸4.66g、谷氨酸鈉3.74g、乳糖 酸鈉6.90ml，攪拌至顏色變清晰；然后加入還原型谷胱甘肽0.92g、利拉利汀1.18 X 10-7~ 3.54 X l(T7g，攪拌至顏色變清晰； (2) 將溶液的PH調至7.30,滲透壓調至320 mOsm/L，雙蒸水定容至1000ml，放置4°C低溫 保存。
[0008] 本發明還提供利拉利汀在制備上述的一種改良的Celsior供心保存液的應用。
[0009] 利拉利汀在所述改良的Celsior供心保存液中用于預防供心缺血復灌損傷。
[0010]利拉利汀在所述改良的Celsior供心保存液中通過激活PI3K/Akt通路達至I」預防供 心缺血復灌損傷的目的。
[0011] 本發明的有益效果是： ①高鈉 (lOOmmol / L)和低鉀（15mm〇l / L)可提高灌注效果，縮短供心降溫時間。
[0012] ②低鉀（15mmol / L)即可使供心快速停搏，又可減輕缺血導致的內皮和細胞損 傷。
[0013] ③高鈉 （lOOmmol / L)和高鎂（13mmol / L)可限制鈣內流，阻止心肌細胞內"鈣超 載。
[0014] ④微量鈣(0.25mmol / L)可避免"鈣反常"現象。
[0015] ⑤甘露醇和乳糖酸鹽可阻止細胞水腫和間質水腫。
[0016] ⑥組氨酸/乳糖酸緩沖系統，可預防細胞內中毒并促進能量再生。
[0017] ⑦谷氨酸可促進心肌細胞在缺血再灌注期間的能量的合成。
[0018] ⑧添加的利拉利汀作為DPP-4抑制劑，研究發現其可通過激活PI3K/Akt通路而延 長供心低溫保存時間、促進供心復灌后心功能的恢復。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1，改良Ce 1 s i or供心保存液的配方（以1000ml為例）。
[0020]原材料的準備:氯化鉀1.12g;氯化鎂2.64g;氯化鈣O.Olg;甘露醇10.93g;組氨酸 4.66g;谷氨酸鈉3.74g;乳糖酸鈉6.90ml;還原型谷胱甘肽0.92g;利拉利汀1.18 X 10-7~ 3.54Χ 10-7g;足量雙蒸水。
[0021] 實施例2,改良Celsior供心保存液的制備方法（以配置1000ml為例）。
[0022] 將800ml雙蒸水加入大于1000ml容器中，再依次加入氯化鉀1.12g、氯化鎂2.64g、 氯化鈣0.01 g，攪拌至顏色變清晰;再加入甘露醇10.93g、組氨酸4.66g、谷氨酸鈉3.74g、乳 糖酸鈉6.90ml，攪拌至顏色變清晰;然后加入還原型谷胱甘肽0.92g、利拉利汀1.18 X 10-7~ 3.54 X 10-7g，攪拌至顏色變清晰;將溶液的ΡΗ調至7.30，滲透壓調至320 mOsm/L，雙蒸水定 容至1000ml，放置4°C低溫保存。
[0023]實施例3,改良Celsior供心保存液效果的實驗。
[0024]采用離體鼠心非循環式Langendorff灌流功能測試模型，通過與單純Celsior供心 保存液相比較，研究自行設計的一種改良Ce 1 s ior供心保存液較長時間（9小時)4 °C低溫保 存離體鼠心的保存效果。
[0025] 受試對象:雄性SD大鼠，體重250~300g。
[0026] 根據保存液成分不同分組為： 組1:單純Ce 1 sior液停搏并保存9小時組(Ce 1 sior); 組2: DPP-4抑制劑低濃度(Celsior液中含有0.25nmol/L的利拉利汀）并保存9小時組 (0.25nM)； 組3:DPP-4抑制劑中濃度（Celsior液中含有0.5nm〇VL的利拉利汀）并保存9小時組 (0.5nM)； 組4:DPP-4抑制劑高濃度(Celsior液中含有0.75nmol/L的利拉利汀）并保存9小時組 (0.75nM)〇
[0027] 實施過程： 大鼠稱重后開胸，于主動脈分叉處剪離心臟，轉移至預冷的KH液中去除殘血后迅速轉 移并固定于Langendorff灌流裝置上，用預先通入95% 02和5% C02充分飽和的KH液行常規逆 行恒壓灌注(76 mmHg)，整個灌流期間保持溫度恒定于37°C。切開左心耳，將連有壓力傳感 器的空球囊送入左心室，壓力傳感器與MedLab生物信號采集處理系統連接，向球囊內注水， 使離體鼠心左心室舒張末期壓力維持在6~8mmHg，并記錄球囊注水量。平衡灌注30min后，通 過MedLab生物信號采集處理系統記錄大鼠心室血流動力學指標心率(HR)、左心室發展壓 (LVDP)、左心室壓力變化率（土 dP/dtmax)等，并測定冠脈流出量(CF)。然后取下心臟，經主 動脈根部逆行灌注心臟低溫保存液(Celsior液），使心臟迅速停搏后置于含不同濃度藥物 的CelsioH呆存液中，低溫（4°C)保存9h。低溫保存結束后取出心臟，將心臟重新置于 Langendorff灌流裝置中，插入空球囊后調節注水量使其與保存前一致。用恒溫(37°C)，95% 02和5% C02飽和的KH液再次灌注60min，記錄灌流30、45、60min時的血流動力學指標。
[0028]對實例1所測定指標結果如下： 表1利拉利汀對冷保存9h后供心HR和LVDP恢復率的影響(Mean 土 SEM，η = 8)
與 Ce 1 s ior組相比，*P〈0 · 05，**P〈0 · 01。
[0029] 表2利拉利汀對冷保存9h后供心HR X LVDP恢復率的影響(Mean 土 SEM，η = 8)
與Celsior組相比，林P〈0.01。
[0030] 表3利拉利汀對冷保存9h后供心+dP/dtmax和-dP/dtmax恢復率的影響(Mean 土 SEM，n =?)
與 Ce 1 s ior組相比，*Ρ〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01。
[0031] 表4利拉利汀對冷保存9h后供心冠脈流量恢復率的影響(Mean 土 SEM，η = 8)
與 Ce 1 s ior組相比，*P〈0 · 05，**P〈0 · 01。
[0032] 結果分析如下： 1 ·心功能的恢復:在低溫保存前，各組大鼠離體心臟LVDP、HR、HRXLVDP、+dP/dtmax 和-dP/dtmax均無顯著性差異(P>0.05)。與保存前相比，大鼠離體心臟單純Celsior液低溫 保存9h后，隨著復灌的延長（30~60min)，LVDP、HR X LVDP、+dP/dtmax和-dP/dtmax均顯著下 降(P〈〇. 05)。與Celsior組相比，在Celsior液中加入3種不同濃度(0.25、0.5、0.75nmmol/L) 的利拉利汀均可顯著提高復灌時上述各項指標的恢復(P〈〇. 05)，其中0.75nmol/L利拉利 汀組的恢復率顯著高于0.25 nmol/L及0.5 nmol/L組(Ρ〈0·01)〇
[0033] 2.冠脈流量的恢復:在低溫保存前，各組大鼠離體心臟冠脈流量無顯著性差異(Ρ >0.05)。與保存前相比，大鼠離體心臟單純Celsior液低溫保存9h后，隨著復灌的延長(30~ 60min)，冠脈流量明顯下降（P〈0 · 05)。與Celsior組相比，0 · 25nmol/L~0 · 75 nmol/L DPP-4 抑制劑組冠脈流量恢復率均顯著提升(P〈〇.〇l)，但復灌45min、60min后，0.25 nmol/L DPP-4抑制劑組與Cels ior組之間無顯著差異(P>0.05) 實驗證明，用本改良的CelsioH呆存液4°C下較長時間(9小時)保存離體鼠心，并能有效 的促進供心復灌后的心功能恢復。
[0034]以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本 發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種改良的Celsior供心保存液，其特征在于，在1000ml保存液中，組分分別為： 氯化鉀1.12g;氯化鎂2.64g;氯化鈣0.01 g; 甘露醇10.93g;組氨酸4.66g;谷氨酸鈉3.74g;乳糖酸鈉6.90ml; 還原型谷胱甘肽0 · 92g;利拉利汀1 · 18 X 10-7~3 · 54 X 10-7g 余量為雙蒸水。2. 根據權利要求1所述的一種改良的Celsior供心保存液的制備方法，其特征在于，按 照1000ml配置量的具體步驟為， (1) 將800ml雙蒸水加入大于1000ml容器中，再依次加入氯化鉀1.12g、氯化鎂2.64g、氯 化鈣0. 〇lg，攪拌至顏色變清晰;再加入甘露醇10.93g、組氨酸4.66g、谷氨酸鈉3.74g、乳糖 酸鈉6.90ml，攪拌至顏色變清晰；然后加入還原型谷胱甘肽0.92g、利拉利汀1.18 X 10-7~ 3.54 X l(T7g，攪拌至顏色變清晰； (2) 將溶液的PH調至7.30,滲透壓調至320 mOsm/L，雙蒸水定容至1000ml，放置4°C低溫 保存。3. 利拉利汀在制備權利要求1所述的一種改良的Celsior供心保存液的應用。4. 如權利要求3所述的利拉利汀用于預防供心缺血復灌損傷。5. 如權利要求3所述的利拉利汀在所述改良的Ce 1 s ior供心保存液中通過激活PI 3K/ Akt通路達到預防供心缺血復灌損傷的目的。
【文檔編號】A61P9/10GK106035316SQ201610256995
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月25日
【發明人】陳瑩瑩, 鄭鳴之, 何卉蕙, 沈晨露, 章逸洲, 沈岳良
【申請人】浙江大學