一種線蟲培養裝置及供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法

一種線蟲培養裝置及供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法
【專利摘要】一種線蟲培養裝置及供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，涉及一種線蟲培養裝置及線蟲繁殖方法。是要解決現有實驗室供試昆蟲病原線蟲的活體培養方法存在耗時長、產量低及繁殖效率低的問題。裝置包括內層篩網和外層儲水盆，內層篩網的邊緣向外延伸形成外沿，所述內層篩網的外沿放置在外層儲水盆的邊緣上。方法：一、裁剪兩張直徑相同的圓形中速定性濾紙，墊在培養皿蓋中，將末齡大蠟螟幼蟲放在培養皿中的濾紙上，侵染期線蟲的水懸液浸潤濾紙，扣上皿底，置于恒溫箱內，再置于培養箱中，待大蠟螟全部死亡；二、將死亡的大蠟螟轉移到線蟲培養裝置的內層篩網上，外層儲水盆里裝有無菌水，置于培養箱中，收集外層儲水盆里的線蟲懸液。本發明用于培養線蟲。
【專利說明】
一種線蟲培養裝置及供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種線蟲培養裝置及線蟲繁殖方法。
【背景技術】
[0002]昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic Nematode，EPN)已成功用于防治地下害蟲，如韭蛆、蠐螬和地老虎等。但由于生產成本遠高于化學藥劑，目前廠家只能按照用戶訂單進行生產。因實驗室、溫室和田間試驗供試昆蟲病原線蟲的用量不是很大，不同的實驗會用到不同種或品系線蟲，生產廠家無法及時提供，并且廠家生產的線蟲產品有些是不同種線蟲混合的。因此實驗室供試昆蟲病原線蟲的獲得都是自行繁殖。
[0003]目前實驗室生測、溫室盆栽和田間小區或大區試驗用的昆蟲病原線蟲一直采用White-trap的繁殖方法，當昆蟲病原線蟲從昆蟲體表出現時，利用線蟲的趨水性，病原線蟲從雙層濾紙的小培養皿內爬入其外層裝有水的大培養皿內，然后收集大培養皿內含有線蟲的水懸液即可。該方法存在很多問題:線蟲迀移距離較長，并且每天要將小培養皿內的濾紙保濕，否則影響線蟲迀移速度甚至干死，嚴重影響產量。當小培養皿內的濾紙濕度過大時，因線蟲的趨水性，小皿內的線蟲不會迀移到大皿內的水中，由于小皿內有昆蟲尸體，以及線蟲的共生細菌，無法收集到干凈的線蟲。即使濾紙濕度適合，但是雙層濾紙間和濾紙與皿底間仍有大量不能順利迀移到大皿水中而死亡的線蟲。最終導致線蟲的產量低，進而繁殖效率低。

【發明內容】

[0004]本發明是要解決現有實驗室供試昆蟲病原線蟲的活體培養方法存在耗時長、產量低及繁殖效率低的問題，為實驗室室、溫室和田間試驗提供一種實驗室供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法。
[0005]本發明線蟲培養裝置包括內層篩網和外層儲水盆，所述內層篩網的邊緣向外延伸形成外沿，所述內層篩網的外沿放置在外層儲水盆的邊緣上。所述內層篩網的底部距離外層儲水盆底部的高度為I cm ο
[0006]本發明線蟲培養裝置可以為長方形、正方形、圓形等多種形狀。
[0007]進一步的，所述內層篩網的容積為5?6立方分米。
[0008]進一步的，所述內層篩網的網孔大小為0.2cmX0.2cm。
[0009]利用上述線蟲培養裝置進行實驗室和田間試驗供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖的方法，按以下步驟進行:
[0010]—、裁剪兩張直徑相同的圓形中速定性濾紙，并將兩張中速定性濾紙重疊墊在培養皿的上蓋中，其中中速定性濾紙的直徑與培養皿上蓋的直徑相同，再將末齡大蠟螟幼蟲放在培養皿中的濾紙上，密度為23?31頭/平方分米，然后采用500?2000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙(即為接種或侵染)，再倒扣上培養皿的底，然后將培養皿置于10°C?15°C恒溫箱內(以防室溫下大蠟螟吐絲結繭，轉移大蠟螟時費時)，24h?48h后再將培養皿轉至25 °C培養箱中，待大蠟螟全部死亡；
[0011]二、將死亡的大蠟螟轉移到線蟲培養裝置的內層篩網上，每個線蟲培養裝置內放入150?300頭大蠟螟，外層儲水盆里裝有無菌水，水面剛剛接觸到內層篩網的底部，水位高度不超過內層篩網的上表面，然后用鋁箔紙蓋上線蟲培養裝置，繼續置于25°C培養箱中，從用侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙開始計算，分別于第10?12天、第14?15天、第18天和第21天收集外層儲水盆里的線蟲懸液。
[0012]每次收集外層儲水盆里的液體后，再向外層儲水盆里裝入無菌水，水面剛剛接觸到內層篩網的底部。
[0013]本發明優點:
[0014]采用本發明的方法繁殖異小桿線蟲Heterorhabditis bacter1phora-HBN和斯氏線蟲Steinernema feltiae_IGA，每克大錯螟繁殖出的侵染期病原線蟲的產量是傳統White-trap法產量的8.2倍和4.5倍，相應成本分別降低到約八分之一和四分之一。本發明方法顯著提高了線蟲的繁殖效率，從而保證試驗中供試昆蟲病原線蟲的用量。本發明方法簡單，易操作。
[0015]本發明將培養皿的皿底倒扣在皿蓋上，目的是防止大蠟螟逃避被侵染。如果將大蠟螟放置在皿底再蓋上皿蓋，線蟲在侵染大蠟螟時，在25 °C培養箱中大蠟螟會爬行得更快，為了逃避被侵染，大蠟螟會鉆入2層濾紙的夾層或2層濾紙下面，因為培養皿底比皿蓋小，濾紙的邊緣只能露在皿底里面，待大蠟螟死亡后往外轉移時，需要揭開雙層濾紙尋找大蠟螟尸體比較浪費時間；如果將培養皿底倒扣在皿蓋上，皿底會壓住培養皿蓋里的濾紙邊緣，這樣可以防止大蠟螟鉆到下面，轉移時省事，死亡的大蠟螟都在濾紙上面。
[0016]針對本發明的繁殖方法設計了專用的線蟲培養裝置，該裝置簡易，大大縮短了線蟲從昆蟲體表出現后向水中迀移的距離，顯著降低了線蟲的死亡率，大大提高了產量，進而降低了成本;不用每天保濕濾紙和收集線蟲，省時省工。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明線蟲培養裝置的結構示意圖，其中I為內層篩網，2為外層儲水盆，3為內層篩網的外沿。
【具體實施方式】
[0018]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0019]【具體實施方式】一:結合圖1說明本實施方式，本實施方式線蟲培養裝置包括內層篩網I和外層儲水盆2，所述內層篩網I的邊緣向外延伸形成外沿3，所述內層篩網I的外沿3放置在外層儲水盆2的邊緣上，所述內層篩網I的底部距離外層儲水盆2底部的高度為lcm。
[0020]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:所述內層篩網I的容積為5?6立方分米。其它與【具體實施方式】一相同。
[0021 ]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:所述內層篩網I的網孔大小為0.2cm X 0.2cm。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0022]【具體實施方式】四:本實施方式實驗室供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖的方法，按以下步驟進行:
[0023]—、裁剪兩張直徑相同的圓形中速定性濾紙，并將兩張中速定性濾紙重疊墊在培養皿的上蓋中，其中中速定性濾紙的直徑與培養皿上蓋的直徑相同，再將末齡大蠟螟幼蟲放在培養皿中的濾紙上，密度為23?31頭/平方分米，然后采用500?2000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙，再倒扣上培養皿的底，然后將培養皿置于10 °C?15 °C恒溫箱內，24h?48h后再將培養皿置于25°C培養箱中，待大蠟螟全部死亡；
[0024]二、將死亡的大蠟螟轉移到線蟲培養裝置的內層篩網上，每個線蟲培養裝置內放入150?300頭大蠟螟，外層儲水盆里裝有無菌水，水面剛剛接觸到內層篩網的底部，水位高度不超過內層篩網的上表面，然后用鋁箔紙蓋上線蟲培養裝置，繼續置于25°C培養箱中，從侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙開始計算，分別于第10?12天、第14?15天、第18天和第21天收集外層儲水盆里的線蟲懸液。
[0025]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】四不同的是:所述昆蟲病原線蟲為異小桿線蟲Heterorhabditis bacter1phora-HBN或其萬氏線蟲Steinernema feltiae-1GA。其它與【具體實施方式】四相同。
[0026]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】四或五不同的是:步驟一中密度為25?28頭/平方分米。其它與【具體實施方式】四或五相同。
[0027]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】四至六之一不同的是:步驟一中采用1000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙。其它與【具體實施方式】四至六之一相同。
[0028]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】四至七之一不同的是:步驟二中每個線蟲培養裝置內放入200?250頭大蠟螟。其它與【具體實施方式】四至七之一相同。
[0029]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】四至八之一不同的是:步驟二中每次收集外層儲水盆里的液體后，再向外層儲水盆里裝入無菌水，水面剛剛接觸到內層篩網的底部。其它與【具體實施方式】四至八之一相同。
[0030]采用下述試驗驗證本發明效果:
[0031]實施例1:
[0032]結合圖1說明本實施例，本實施例線蟲培養裝置包括內層篩網I和外層儲水盆2，所述內層篩網I的邊緣向外延伸形成外沿3，所述內層篩網I的外沿3放置在外層儲水盆2的邊緣上，所述內層篩網I的底部距離外層儲水盆2底部的高度為lcm。該線蟲培養裝置為長方體，所述內層篩網I的尺寸為:長31 cm X寬23cm X高8cm，所述內層篩網I的網孔大小為0.2cmX 0.2cm0
[0033]試驗一:
[0034]利用上述線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，具體是按以下步驟完成的:
[0035]首先按直徑為90mm培養皿的皿蓋大小裁剪兩張中速定性濾紙，并墊在直徑為90mm的培養皿蓋中，再將15頭末齡大蠟螟幼蟲放在直徑為90mm培養皿中的濾紙上，然后采用2mL的1000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤直徑為90mm培養皿中的濾紙，再倒扣上直徑為90mm的培養皿底。然后將這些被侵染的大蠟螟置于10°C恒溫箱內，24h后再將被侵染的大蠟螟置于25°C培養箱中，待大蠟螟死亡(48h)后，將死亡的大蠟螟轉移到線蟲培養裝置的內層篩網I上，每10皿大蠟螟轉移到I個線蟲培養裝置內，共做3個線蟲培養裝置，外層儲水盆2里裝有無菌水，水面剛剛接觸內層篩網I的底部，水位高度不超過內層篩網I的上表面，然后用鋁箔紙蓋上整套線蟲培養裝置，繼續置于25°C培養箱中，從侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙開始計算，分別于第12d、15d、18d和21d收集外層儲水盆2的線蟲懸液。這個試驗重復2次。
[0036]本試驗所述的IO O O條/ m L侵染期線蟲的水懸液中的線蟲為異小桿線蟲Heterorhabditis bacter1phora—HBN。
[0037]通過計算可知:本試驗每克大蠟螟幼蟲能繁殖出約72萬條異小桿線蟲Heterorhabditis bacter1phora-HBN。而米用常規的White-trap法每克大錯螟幼蟲能繁殖出該線蟲約8.8萬條。
[0038]試驗二:
[0039]利用上述線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，具體是按以下步驟完成的:
[0040]首先按直徑為90mm培養皿的皿蓋大小裁剪兩張中速定性濾紙，并墊在直徑為90mm的培養皿蓋中，再將15頭末齡大蠟螟幼蟲放在直徑為90mm培養皿中的濾紙上，然后采用2mL的1000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤直徑為90mm培養皿中的濾紙，再倒扣上直徑為90mm的培養皿底。然后將這些被侵染的大蠟螟置于10°C恒溫箱內，24h后再將被侵染的大蠟螟置于25°C培養箱中，待大蠟螟死亡(48h)后，將死亡的大蠟螟轉移到線蟲培養裝置的內層篩網I上，每10皿大蠟螟轉移到I個內層篩網I內，共做3個線蟲培養裝置，外層儲水盆2里裝有無菌水，水面剛剛接觸內層篩網I的底部，水位高度不超過內層篩網I的上表面，然后用鋁箔紙蓋上整套線蟲培養裝置，繼續置于25°C培養箱中，從侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙開始計算，分別于第10d、14d和18d收集外層儲水盆2的線蟲懸液。這個試驗重復2次。[0041 ] 本試驗所述的1000條/mL侵染期線蟲的水懸液中的線蟲為斯氏線蟲Steinernemafeltiae-1GA。
[OO42]通過計算可知:本試驗每克大錯螟幼蟲能繁殖出約8.9萬條斯氏線蟲Steinernemafeltiae-1GA。而采用常規的White-trap法每克大錯螟幼蟲能繁殖出該線蟲約2萬條。
【主權項】
1.一種線蟲培養裝置，其特征在于該裝置包括內層篩網(I)和外層儲水盆(2)，所述內層篩網(I)的邊緣向外延伸形成外沿(3)，所述內層篩網(I)的外沿(3)放置在外層儲水盆(2)的邊緣上，所述內層篩網(I)的底部距離外層儲水盆(2)底部的高度為lcm。2.根據權利要求1所述的一種線蟲培養裝置，其特征在于所述內層篩網(I)的容積為5?6立方分米。3.根據權利要求1所述的一種線蟲培養裝置，其特征在于所述內層篩網(I)的網孔大小*0.2cmX0.2cm。4.利用權利要求1所述的線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，其特征在于該方法按以下步驟進行: 一、裁剪兩張直徑相同的圓形中速定性濾紙，并將兩張中速定性濾紙重疊墊在培養皿的上蓋中，其中中速定性濾紙的直徑與培養皿上蓋的直徑相同，再將末齡大蠟螟幼蟲放在培養皿中的濾紙上，密度為23?31頭/平方分米，然后采用500?2000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙，再倒扣上培養皿的底，然后將培養皿置于10°C?15°C恒溫箱內，24h?48h后再將培養皿轉至25 °C培養箱中，待大蠟螟全部死亡； 二、將死亡的大蠟螟轉移到線蟲培養裝置的內層篩網上，每個線蟲培養裝置內放入150?300頭大蠟螟，外層儲水盆里裝有無菌水，水面剛剛接觸到內層篩網的底部，水位高度不超過內層篩網的上表面，然后用鋁箔紙蓋上線蟲培養裝置，繼續置于25°C培養箱中，從用侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙開始計算，分別于第10?12天、第14?15天、第18天和第21天收集外層儲水盆里的線蟲懸液。5.利用權利要求4所述的線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，其特征在于步驟一中所述線蟲為異小桿線蟲Heterorhabditis bacter1phora_HBN或斯氏線蟲Steinernemafeltiae-1GA06.利用權利要求4所述的線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，其特征在于步驟一中密度為25?28頭/平方分米。7.利用權利要求4所述的線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，其特征在于步驟一中采用1000條/mL侵染期線蟲的水懸液浸潤培養皿中的濾紙。8.利用權利要求4所述的線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，其特征在于步驟二中每個線蟲培養裝置內放入200?250頭大蠟螟。9.利用權利要求4所述的線蟲培養裝置進行供試昆蟲病原線蟲的簡易繁殖方法，其特征在于步驟二中每次收集外層儲水盆里的液體后，再向外層儲水盆里裝入無菌水，水面剛剛接觸到內層篩網的底部。
【文檔編號】A01K67/033GK106035238SQ201610369836
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】李春杰, 王從麗
【申請人】中國科學院東北地理與農業生態研究所