一種寒蘭人工種子制作方法
【專利摘要】本發明涉及植物培養技術領域，具體涉及一種寒蘭人工種子制作方法，用寒蘭種子誘導產生的原球莖作為繁殖體制作人工種子，具體步驟包括：選種、消毒、采種與原球莖誘導、原球莖增殖培養及人工種子的制作，將寒蘭種子誘導產生的原球莖作為人工種子的繁殖體，可以使繁殖后的苗株遺傳性好、不發生突變，從而保護了苗株的優秀品質。同時采用制作人工種子，可以適用于機械化生產，縮短了組織培養周期，降低了成本，提高了生產效率，同時方便運輸和儲藏，本發明通過生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規模化、產業化培養高品質寒蘭提供了技術支持。
【專利說明】
一種寒蘭人工種子制作方法
技術領域
[0001] 本發明涉及植物培養技術領域，具體涉及一種寒蘭人工種子制作方法。
【背景技術】
[0002] 寒蘭為蘭科蘭屬地生植物，假鱗莖狹卵球形，包藏于葉基之內。葉帶形，薄革質，暗 綠色，前部邊緣常有細齒。花常為淡黃綠色而具淡黃色唇瓣，也有其他色澤，常有濃烈香氣； 株型修長健美，葉姿優雅俊秀，花色艷麗多變，香味清醇久遠，凌霜冒寒吐芳，實為可貴，因 此有"寒蘭"之名，為國蘭之一，生于林下、溪谷旁或稍蔭蔽、濕潤、多石之土壤上，海拔400-2400米。分布于中國、日本南部、朝鮮半島南端。
[0003] 由于寒蘭種子非常微小，幾乎無胚乳，在自然條件下種子萌發率極低，因此在生產 實踐中多采用分株方式或組織培養進行繁殖，但是分株培養繁殖率低，時間長，不能滿足市 場需要，組織培養能在一定程度上解決快速繁殖的難題，但是依然存在轉接次數多、成本 高、移栽成活率低等問題，特別是不方便運輸儲藏，所以人工種子繁殖方式應用越來越廣 泛，目前，采用人工種子在寒蘭繁殖方面還未見報道，并且大多數人工種子采用的繁殖體， 都是通過組織培養誘導假鱗莖、花梗腋芽或莖尖產生原球莖，這種方式往往使繁殖體產生 病毒的同時，使繁殖后的苗株發生突變，不能有效遺傳苗株的優秀品質。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種寒蘭人工種子制作方法，從而縮短組織培養周期、降 低成本的同時，提高生產效率。
[0005] 為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為:一種寒蘭人工種子制作方法，用寒 蘭種子誘導產生的原球莖作為繁殖體制作人工種子。
[0006] 如上所述的一種寒蘭人工種子制作方法，包括以下步驟：
[0007] (1)選種:采取授粉130~140天后的寒蘭蒴果，且蒴果無開裂；
[0008] (2)消毒：先用稀釋的洗潔精溶液擦洗蒴果表面，然后用清水沖洗3~5min，再用 10 %的次氯酸鈉溶液浸泡12~14 m i η，浸泡后用清水沖洗1~2 m i η，再用7 5 %的酒精消毒 lmin，接著用0.2%的升萊消毒3111；[11，然后用無菌水沖洗2~31]1；[11，沖洗后將蒴果放置在無菌 的培養皿中備用；
[0009] (3)采種與原球莖誘導:將消毒后的蒴果放置在無菌工作臺上，切開蒴果，將種子 移入有少量無菌水的培養瓶中，輕輕搖動使之分散均勻，然后用無菌吸管將種子分移到誘 導培養基上，并使種子均勻地分布于誘導培養基表面，所述誘導培養基為：l/2MS+90~ 110mg/L肌醇+0 · 4~0 · 6mg/L煙酸+0.4~0 · 6mg/L VB6+0 · 1 ~0 · 2mg/L VB1+1 ~3mg/L甘氛酸 + 1~2g/L蛋白胨+160~180mg/L磷酸二氫鈉+18~22g/L鹿糖+8~10g/L瓊脂+90~110g/L香 蕉汁;pH為5.4~5.8，溫度為22~25°(：，光照時間為1211/(1，光照強度為1500~20001叉；
[0010] (4)原球莖增殖培養:將誘導出的原球莖接種到增殖培養基中繼續培養，所述增殖 培養基為：1/2MS+0 · 8~1 · 5mg/L 6-BA+0 · 1~0 · 3mg/L NAA+8~12 %椰汁，培養條件：培養溫 度24~26°C，光照時間為12h/d，光照強度為1500~20001x;增殖培養后的寒蘭原球莖用于 制作人工種子的繁殖體；
[0011] (5)人工種子的制作:將上述獲得的繁殖體，均勻懸浮于人工胚乳溶液，采用人工 種皮包埋后，即得人工種子;所述人工胚乳溶液為：1/2MS+0.5~0.7mg/L NAA+8~12 %椰汁 +0 · 4~0 · 6mg/L BA+20~25g/L蔗糖+20~25g/L蘋果酸+0 · 4~0 · 6 %多靈菌+0 · 2 %活性炭+ 15~25mg/L脫落酸;所述人工種皮為:3 %海藻酸鈉+2 %殼聚糖+2 % CaCl2。
[0012] 本發明的有益效果是:將寒蘭種子誘導產生的原球莖作為人工種子的繁殖體，可 以使繁殖后的苗株遺傳性好、不發生突變，從而保護了苗株的優秀品質。同時采用制作人工 種子，可以適用于機械化生產，縮短了組織培養周期，降低了成本，提高了生產效率，同時方 便運輸和儲藏，本發明通過生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規 模化、產業化培養高品質寒蘭提供了技術支持。
【具體實施方式】
[0013] 下面對本發明【具體實施方式】做進一步的闡述。
[0014] 本發明提供的一種寒蘭人工種子制作方法，用寒蘭種子誘導產生的原球莖作為繁 殖體制作人工種子，從而可以使繁殖后的苗株遺傳性好、不發生突變，從而保護了苗株的優 秀品質。具體步驟如下：
[0015] (1)選種:采取授粉130~140天后的寒蘭蒴果，且蒴果無開裂；由于這時的寒蘭蒴 果較成熟，能大大增加種子的誘導成功率，例如采用授粉80天的寒蘭蒴果，這時蒴果還不夠 成熟，以致使種子的誘導成功率大大下降；
[0016] 表1為授粉后不同時間的種子誘導率 「00171
[0018] 由表1可以看出采取授粉130~140天后的寒蘭蒴果，能大大增加種子的誘導成功 率。
[0019] (2)消毒：先用稀釋的洗潔精溶液擦洗蒴果表面，然后用清水沖洗3~5min，再用 10 %的次氯酸鈉溶液浸泡12~14 m i η，浸泡后用清水沖洗1~2 m i η，再用7 5 %的酒精消毒 lmin，接著用0.2%的升萊消毒3111；[11，然后用無菌水沖洗2~31]1；[11，沖洗后將蒴果放置在無菌 的培養皿中備用;消毒是在保證蒴果內部種子活性的同時，保證蒴果的滅菌。
[0020] (3)采種與原球莖誘導:將消毒后的蒴果放置在無菌工作臺上，切開蒴果，將種子 移入有少量無菌水的培養瓶中，輕輕搖動使之分散均勻，然后用無菌吸管將種子分移到誘 導培養基上，并使種子均勻地分布于誘導培養基表面，所述誘導培養基為：l/2MS+90~ 110mg/L肌醇+0 · 4~0 · 6mg/L煙酸+0.4~0 · 6mg/L VB6+0 · 1 ~0 · 2mg/L VB1+1 ~3mg/L甘氛酸 + 1~2g/L蛋白胨+160~180mg/L磷酸二氫鈉+18~22g/L鹿糖+8~lOg/L瓊脂+90~llOg/L香 蕉汁;pH為5.4~5.8，溫度為22~25°(：，光照時間為1211/(1，光照強度為1500~200011;通過 本步驟主要是為了使寒蘭種子誘導出原球莖；
[0021] 表2為誘導培養基的多種實施例
[0022]
[0023] 通過本誘導培養基，能大大增加種子的誘導率，作為優選，所述誘導培養基為：1/ 2MS+100mg/L肌醇+0 · 5mg/L煙酸+0 · 5mg/L VB6+0 · 15mg/L VBl+2mg/L甘氨酸+2g/L蛋白胨+ 170mg/L磷酸二氫鈉+20g/L蔗糖+9g/U京脂+100g//L香蕉汁，即為表2中誘導培養基1的成分 及用量。
[0024] (4)原球莖增殖培養:將誘導出的原球莖接種到增殖培養基中繼續培養，所述增殖 培養基為：1/2MS+0 · 8~1 · 5mg/L 6-BA+0 · 1~0 · 3mg/L NAA+8~12 %椰汁，培養條件：培養溫 度24~26°C，光照時間為12h/d，光照強度為1500~20001x;增殖培養后的寒蘭原球莖用于 制作人工種子的繁殖體;通過本步驟主要是為了使誘導出的原球莖進行增殖，培養出更多 的原球莖，提高生產效率。
[0025] (5)人工種子的制作:將上述獲得的繁殖體，均勻懸浮于人工胚乳溶液，采用人工 種皮包埋后，即得人工種子;所述人工胚乳溶液為：1/2MS+0.5~0.7mg/L NAA+8~12 %椰汁 +0 · 4~0 · 6mg/L BA+20~25g/L蔗糖+20~25g/L蘋果酸+0 · 4~0 · 6 %多靈菌+0 · 2 %活性炭+ 15~25mg/L脫落酸;所述人工種皮為:3 %海藻酸鈉+2 %殼聚糖+2 % CaCl2。
[0026] 表3為人工胚乳溶液的多種實施例
[0027]
[0028] 通過本人工胚乳溶液，能增加人工種子的萌芽率和儲藏時間，作為優選，所述人工 胚乳溶液為：1/2MS+0.6mg/L NAA+10%椰汁+0·5mg/L BA+23g/L蔗糖+23g/L蘋果酸+0·5% 多靈菌+0.2 %活性炭+20mg/L脫落酸，即為表3中人工胚乳溶液1的成分及用量。制作人工種 子的過程為現有技術，這里不做詳細闡述。通過采用制作人工種子，可以適用于機械化生 產，縮短了組織培養周期，降低了成本，提高了生產效率，同時方便運輸和儲藏，本發明通過 生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規模化、產業化培養高品質寒 蘭提供了技術支持。
[0029] 本發明并不限于上述實例，在本發明的權利要求書所限定的范圍內，本領域技術 人員不經創造性勞動即可做出的各種變形或修改均受本專利的保護。
【主權項】
1. 一種寒蘭人工種子制作方法，其特征在于：用寒蘭種子誘導產生的原球莖作為繁殖 體制作人工種子。2. 根據權利要求1所述的一種寒蘭人工種子制作方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 選種:采取授粉130~140天后的寒蘭蒴果，且蒴果無開裂； (2) 消毒:先用稀釋的洗潔精溶液擦洗蒴果表面，然后用清水沖洗3~5min，再用10%的 次氯酸鈉溶液浸泡12~14mi η，浸泡后用清水沖洗1~2m i η，再用7 5 %的酒精消毒lm i η，接著 用0.2 %的升萊消毒3min，然后用無菌水沖洗2~3min，沖洗后將蒴果放置在無菌的培養皿 中備用； (3) 采種與原球莖誘導：將消毒后的蒴果放置在無菌工作臺上，切開蒴果，將種子移入 有少量無菌水的培養瓶中，輕輕搖動使之分散均勻，然后用無菌吸管將種子分移到誘導培 養基上，并使種子均勾地分布于誘導培養基表面，所述誘導培養基為：1/2MS+90~110mg/L 肌醇+〇 · 4~0 · 6mg/L煙酸+0 · 4~0 · 6mg/LVB6+0 · 1 ~0 · 2mg/L VB1+1 ~3mg/L甘氛酸+1 ~2g/L 蛋白胨+160~180mg/L磷酸二氫鈉+18~22g/L鹿糖+8~10g/L瓊脂+90~110g/L香蕉汁;pH 為5.4~5.8，溫度為22~25°(：，光照時間為1211/(1，光照強度為1500~20001叉； (4) 原球莖增殖培養:將誘導出的原球莖接種到增殖培養基中繼續培養，所述增殖培養 基為：1/2MS+0 · 8~1 · 5mg/L 6-BA+0 · 1~0 · 3mg/L NAA+8~12 %椰汁，培養條件：培養溫度24 ~26°C，光照時間為12h/d，光照強度為1500~20001x;增殖培養后的寒蘭原球莖用于制作 人工種子的繁殖體； (5) 人工種子的制作：將上述獲得的繁殖體，均勻懸浮于人工胚乳溶液，采用人工種皮 包埋后，即得人工種子;所述人工胚乳溶液為 ：1/21^+0.5~0.711^/0^\+8~12%椰汁+0.4 ~0 · 6mg/L BA+20~25g/L鹿糖+20~25g/L蘋果酸+0 · 4~0 ·6%多靈菌+0 · 2%活性炭+15~ 25mg/L脫落酸;所述人工種皮為:3 %海藻酸鈉+2 %殼聚糖+2 % CaCl2。
【文檔編號】A01H4/00GK106035091SQ201610547741
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】宋林貴, 王維青
【申請人】成都東山蘭韻農業有限公司