一種白芨組培快繁方法及運用
【專利摘要】本發明公開了一種白芨組培快繁方法，具體包括以下步驟：外植體滅菌方法、白芨種子無菌萌發、種胚形態及種胚突破種皮過程觀察、白芨的組培快繁和用TTC法測定白芨種子活力。本發明方法獲得的白芨苗方法簡單，而且大大降低了育苗成本。本培養方法出芽快，增殖率高，方法簡單，不需要增加組培設備，生產成本低，可批量生產，應用價值高。
【專利說明】
一種白芨組培快繁方法及運用
技術領域
[0001] 本發明涉及中藥材種植技術領域，更具體地說，尤其涉及一種白芨組培快繁方法。 同時，本發明還涉及一種白芨抗氧化的運用。
【背景技術】
[0002] 白芨，屬蘭科植物白芨屬的一種，為多年生草本植物，具有較高的觀賞價值;其干 燥假鱗莖為我國民間傳統中藥材，具有極高的藥用價值，其味苦、甘、澀，性涼，歸肺、胃、肝 經。功能收斂止血、消腫生肌，主治肺胃出血、外傷出血、癰腫瘡瘍、皮膚毅裂、水火燙傷等。 白芨較高的觀賞價值和極高的藥用價值，導致市場需求量不斷增長，據不完全統計，目前白 芨市場需求量己達到4000噸以上，其中藥廠使用量為2000余噸(其中葵花藥業月需求80噸， 年需求1000余噸；江中制藥需求30噸）；出口韓國、臺灣和香港50噸/月，主要用于化妝品生 產;全國醫院藥房等50噸/月。長期以來白芨中藥材主要以野生為主，隨著需求量的增加，導 致野生白芨被過度采挖；同時，由于自然生境的破壞也加劇了野生白芨資源的減少，野生白 芨己瀕臨滅絕，己被中國列為重點保護的野生藥用植物之一。白芨的可持續利用己引起人 們的關注，但白芨種子自然萌發率低，目前主要以分株方式進行繁殖，繁殖率低、繁殖速度 慢；白芨每個萌果具有數萬粒種子，采用種子進行組培快繁，可短期內大量繁殖種苗，是解 決白芨種苗問題的必由之路，但組培苗煉苗栽培技術還不成熟，組培苗移栽成活率低且周 期長，己成為白芨產業化的瓶頸，通過了解白芨的自然萌發生長特性，在此基礎上研究制定 組培苗及移栽技術是解決這一瓶頸的關鍵。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種白芨組培快繁方 法及運用。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0005] -種白芨組培快繁方法，具體包括以下步驟：
[0006] S1、外植體滅菌方法:首先用流水沖洗蒴果26-32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面， 用蒸餾水沖洗2-3遍，在超凈工作臺上先用75%酒精消毒2-3min，再用10%次氯酸鈉溶液浸 泡8-12min，期間不停的搖動，使其消毒徹底，無菌水沖洗4-6遍，無菌濾紙吸干表面水分待 用；
[0007] S2、在無菌條件下剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到培養基表 面；
[0008] S3、白芨種子無菌萌發:基本培養基采用MS特殊說明外，均添加蔗糖30L和瓊脂粉 6.5g/L;培養基按試驗設計在滅菌前添加不同的生長調節劑或有機物；
[0009] S4、培養基高溫滅菌前調pH至5.4，121°C下滅菌12-20min，每處理4次重復；白芨萌 發培養基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球莖、葉片誘導培養基見表1;白芨生根培養基MS+ NAA l.Omg/L;置于光強2000-25001x，光周期16h/8h，溫度23-27°C的條件下培養；
[0010] S5、種胚形態及種胚突破種皮過程觀察:接種剩余種子在NIKON ECLIPSE 55i光學 顯微鏡10倍物鏡下觀察種子胚形態和發育狀況，每個蒴果觀察20個視野并統計數據，以有 胚率表示，結果取平均值，有胚率=(有胚的種子數/總種子數）x 100%;
[0011] S6、白芨的組培快繁:將種子無菌萌發誘導的原球莖及葉片切割后，原球莖縱切， 葉片切割長度在〇. 35-0.6，分別接種到誘導培養基上，觀察其誘導分化結果；
[0012] S7、用TTC法測定白芨種子活力：活種子的胚在呼吸作用過程中進行氧化還原反 應，而死種子則無此反應；當TTC滲入活種子胚細胞內作為氫受體而被脫氫輔酶(NADH2或 NADPH2)上的氫還原時，無色的TTC轉變為紅色的三苯基甲腙(TTF);如果種胚死亡或種胚生 活力衰退，則不能染色或染色較淺。
[0013] 優選的，
[0014]在S7中，所述TTC法測定白芨種子活力的具體過程如下：
[0015]選擇成熟飽滿的蒴果，將各蒴果種子取出混合均勻，取適量種子加入1.5ml離心管 中至0.25ml刻度處，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用膠頭滴管 吹吸使種子混勻，吸取種子轉移至載玻片上，用濾紙吸去染液，體式顯微鏡下統計種子有胚 率和種子活力，各樣品重復3次;有活力種子胚將被染為橙色或者紅色，無活力種子胚不著 色。
[0016] 優選的，在S4中，以MS為基本培養基，添加活性炭0.2g/L，瓊脂7. Og/L，pH 5.8，碳 源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6個處理，處理1的碳源為蔗糖，用量 為30g/L;處理2的碳源為蔗糖，用量為60g/L;處理3的碳源為葡萄糖，用量為30g/L;處理4的 碳源為葡糖糖，用量為60g/L;處理5的碳源為可溶性淀粉，用量為30g/L:處理5的碳源為可 溶性淀粉，用量為60g/L;每種處理重復30瓶。每次觀察隨機取3瓶，每瓶觀察6個視野，在 OLYMPUS SZX-16體式顯微鏡下觀察，并用Canon G12數碼相機拍照保存圖片資料。
[0017] 優選的，本發明采用組培瓶規格為240ml高90mm直徑68mm口徑62mm，培養基的添加 量均為30ml。
[0018] 本發明還提供一種白芨抗氧化的運用，
[0019]( - )對鐵原子還原能力的影響：
[0020] 以lmg/mL沒食子酸為陽性對照，稀釋20后為對照品溶液;分別取供試品溶液和對 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸緩沖溶 液0.5mL，再加1 %鐵氰化鉀0.5mL;混合均勻后，50°C水浴20min;水浴結束后，再每只試管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，離心（3000轉/分鐘）101]1；[11 ;離心結束后，取上清液11]1]^，加入蒸餾 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化鐵;將上述步驟中的藥物換成對應容積的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化鐵改成0. lmL蒸餾水為空白，700nm測定吸光度;平行3份;將上述加入的 藥物換成對應體積的甲醇，按上述方法制備陰性對照；
[0021] (二)對DPPH清除能力的影響：
[0022] 取白及塊莖醇提物稀釋40倍，白及須根醇提物稀釋200倍。然后分別取稀釋液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入適量甲醇至體積為2.425111以即用移液槍精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇為空白，全波長掃描，在最大吸收波 長處測定吸光度；同時，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH測定吸光度記為ADPPH。按以下 公式計算清除率，并計算白及塊莖和須根的半數抑制率IC5Q;同時，以lmg/mL的沒食子酸為 陽性對照，稀釋20倍，按上述操作，計算沒食子酸的清除率和半數抑制率IC50;
[0023] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0024] 本發明提供的一種白芨組培快繁方法，與現有技術相比：
[0025]第一，本發明方法獲得的白芨苗方法簡單，而且大大降低了育苗成本。本培養方法 出芽快，增殖率高，方法簡單，不需要增加組培設備，生產成本低，可批量生產，應用價值高；
[0026] 第二，白芨的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節、氣候條件與土壤等因素 的制約，可排除病蟲害的侵襲和農藥殘留的影響，嚴格控制白芨的質量；
[0027] 第三使用本發明提供的快繁技術得到白芨幼苗，進行人工栽培，移栽成活率比組 培苗要高，更能快速適應自然環境，能縮短白芨種植年限。
【具體實施方式】
[0028] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本 發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不 用于限定本發明。
[0029] 實施例1
[0030] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0031 ] -種白芨組培快繁方法，具體包括以下步驟：
[0032] S1、外植體滅菌方法:首先用流水沖洗蒴果26min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 餾水沖洗2遍，在超凈工作臺上先用75 %酒精消毒2min，再用10 %次氯酸鈉溶液浸泡8min， 期間不停的搖動，使其消毒徹底，無菌水沖洗4遍，無菌濾紙吸干表面水分待用；
[0033] S2、在無菌條件下剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到培養基表 面；
[0034] S3、白芨種子無菌萌發:基本培養基采用MS特殊說明外，均添加蔗糖30L和瓊脂粉 6.5g/L;培養基按試驗設計在滅菌前添加不同的生長調節劑或有機物；
[0035] S4、培養基高溫滅菌前調pH至5.4，121°C下滅菌12min，每處理4次重復；白芨萌發 培養基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球莖、葉片誘導培養基見表1;白芨生根培養基MS+ NAA l.Omg/L;置于光強2000-25001x，光周期16h/8h，溫度23-27°C的條件下培養；
[0036] 在S4中，以MS為基本培養基，添加活性炭0.2g/L，瓊脂7. Og/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、 葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6個處理，處理1的碳源為蔗糖，用量為30g/L; 處理2的碳源為蔗糖，用量為60g/L;處理3的碳源為葡萄糖，用量為30g/L;處理4的碳源為葡 糖糖，用量為60g/L;處理5的碳源為可溶性淀粉，用量為30g/L:處理5的碳源為可溶性淀粉， 用量為60g/L;每種處理重復30瓶。每次觀察隨機取3瓶，每瓶觀察6個視野，在OLYMPUS SZX-16體式顯微鏡下觀察，并用Canon G12數碼相機拍照保存圖片資料。本發明采用組培瓶規格 為240ml高90mm直徑68mm 口徑62mm，培養基的添加量均為30ml。
[0037] S5、種胚形態及種胚突破種皮過程觀察:接種剩余種子在NIKON ECLIPSE 55i光學 顯微鏡10倍物鏡下觀察種子胚形態和發育狀況，每個蒴果觀察20個視野并統計數據，以有 胚率表示，結果取平均值，有胚率=(有胚的種子數/總種子數）x 100%;
[0038] S6、白芨的組培快繁:將種子無菌萌發誘導的原球莖及葉片切割后，原球莖縱切， 葉片切割長度在ο. 35，分別接種到誘導培養基上，觀察其誘導分化結果；
[0039] S7、用TTC法測定白芨種子活力：活種子的胚在呼吸作用過程中進行氧化還原反 應，而死種子則無此反應；當TTC滲入活種子胚細胞內作為氫受體而被脫氫輔酶(NADH2或 NADPH2)上的氫還原時，無色的TTC轉變為紅色的三苯基甲腙(TTF);如果種胚死亡或種胚生 活力衰退，則不能染色或染色較淺。
[0040] 在S7中，所述TTC法測定白芨種子活力的具體過程如下：
[0041] 選擇成熟飽滿的蒴果，將各蒴果種子取出混合均勻，取適量種子加入1.5ml離心管 中至0.25ml刻度處，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用膠頭滴管 吹吸使種子混勻，吸取種子轉移至載玻片上，用濾紙吸去染液，體式顯微鏡下統計種子有胚 率和種子活力，各樣品重復3次;有活力種子胚將被染為橙色或者紅色，無活力種子胚不著 色。
[0042] 本發明還提供一種白芨抗氧化的運用，
[0043]( - )對鐵原子還原能力的影響：
[0044]以lmg/mL沒食子酸為陽性對照，稀釋20后為對照品溶液;分別取供試品溶液和對 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸緩沖溶 液0.5mL，再加1 %鐵氰化鉀0.5mL;混合均勻后，50°C水浴20min;水浴結束后，再每只試管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，離心（3000轉/分鐘）101]1；[11 ;離心結束后，取上清液11]1]^，加入蒸餾 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化鐵;將上述步驟中的藥物換成對應容積的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化鐵改成0. lmL蒸餾水為空白，700nm測定吸光度;平行3份;將上述加入的 藥物換成對應體積的甲醇，按上述方法制備陰性對照；
[0045](二)對DPPH清除能力的影響：
[0046] 取白及塊莖醇提物稀釋40倍，白及須根醇提物稀釋200倍。然后分別取稀釋液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入適量甲醇至體積為2.425111以即用移液槍精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇為空白，全波長掃描，在最大吸收波 長處測定吸光度；同時，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH測定吸光度記為ADPPH。按以下 公式計算清除率，并計算白及塊莖和須根的半數抑制率IC 5Q;同時，以lmg/mL的沒食子酸為 陽性對照，稀釋20倍，按上述操作，計算沒食子酸的清除率和半數抑制率IC 50;
[0047] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0048] 實施例2
[0049] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0050] -種白芨組培快繁方法，具體包括以下步驟：
[0051] S1、外植體滅菌方法:首先用流水沖洗蒴果28min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 餾水沖洗3遍，在超凈工作臺上先用75 %酒精消毒3min，再用10 %次氯酸鈉溶液浸泡lOmin， 期間不停的搖動，使其消毒徹底，無菌水沖洗5遍，無菌濾紙吸干表面水分待用；
[0052] S2、在無菌條件下剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到培養基表 面；
[0053] S3、白芨種子無菌萌發:基本培養基采用MS特殊說明外，均添加蔗糖30L和瓊脂粉 6.5g/L;培養基按試驗設計在滅菌前添加不同的生長調節劑或有機物；
[0054] S4、培養基高溫滅菌前調pH至5.4，121°C下滅菌12-20min，每處理4次重復；白芨萌 發培養基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球莖、葉片誘導培養基見表1;白芨生根培養基MS+ NAA l.Omg/L;置于光強2000-25001x，光周期16h/8h，溫度26°C的條件下培養；
[0055] 在S4中，以MS為基本培養基，添加活性炭0.2g/L，瓊脂7. Og/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、 葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6個處理，處理1的碳源為蔗糖，用量為30g/L; 處理2的碳源為蔗糖，用量為60g/L;處理3的碳源為葡萄糖，用量為30g/L;處理4的碳源為葡 糖糖，用量為60g/L;處理5的碳源為可溶性淀粉，用量為30g/L:處理5的碳源為可溶性淀粉， 用量為60g/L;每種處理重復30瓶。每次觀察隨機取3瓶，每瓶觀察6個視野，在OLYMPUS SZX-16體式顯微鏡下觀察，并用Canon G12數碼相機拍照保存圖片資料。本發明采用組培瓶規格 為240ml高90mm直徑68mm 口徑62mm，培養基的添加量均為30ml。
[0056] S5、種胚形態及種胚突破種皮過程觀察:接種剩余種子在NIKON ECLIPSE 55i光學 顯微鏡10倍物鏡下觀察種子胚形態和發育狀況，每個蒴果觀察20個視野并統計數據，以有 胚率表示，結果取平均值，有胚率=(有胚的種子數/總種子數）x 100%;
[0057] S6、白芨的組培快繁:將種子無菌萌發誘導的原球莖及葉片切割后，原球莖縱切， 葉片切割長度在〇. 5，分別接種到誘導培養基上，觀察其誘導分化結果；
[0058] S7、用TTC法測定白芨種子活力：活種子的胚在呼吸作用過程中進行氧化還原反 應，而死種子則無此反應；當TTC滲入活種子胚細胞內作為氫受體而被脫氫輔酶(NADH2或 NADPH2)上的氫還原時，無色的TTC轉變為紅色的三苯基甲腙(TTF);如果種胚死亡或種胚生 活力衰退，則不能染色或染色較淺。
[0059] 在S7中，所述TTC法測定白芨種子活力的具體過程如下：
[0060] 選擇成熟飽滿的蒴果，將各蒴果種子取出混合均勻，取適量種子加入1.5ml離心管 中至0.25ml刻度處，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用膠頭滴管 吹吸使種子混勻，吸取種子轉移至載玻片上，用濾紙吸去染液，體式顯微鏡下統計種子有胚 率和種子活力，各樣品重復3次;有活力種子胚將被染為橙色或者紅色，無活力種子胚不著 色。
[0061 ]本發明還提供一種白芨抗氧化的運用，
[0062]( - )對鐵原子還原能力的影響：
[0063]以lmg/mL沒食子酸為陽性對照，稀釋20后為對照品溶液;分別取供試品溶液和對 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸緩沖溶 液0.5mL，再加1 %鐵氰化鉀0.5mL;混合均勻后，50°C水浴20min;水浴結束后，再每只試管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，離心（3000轉/分鐘）101]1；[11 ;離心結束后，取上清液11]1]^，加入蒸餾 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化鐵;將上述步驟中的藥物換成對應容積的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化鐵改成0. lmL蒸餾水為空白，700nm測定吸光度;平行3份;將上述加入的 藥物換成對應體積的甲醇，按上述方法制備陰性對照；
[0064](二)對DPPH清除能力的影響：
[0065]取白及塊莖醇提物稀釋40倍，白及須根醇提物稀釋200倍。然后分別取稀釋液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入適量甲醇至體積為2.425111以即用移液槍精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇為空白，全波長掃描，在最大吸收波 長處測定吸光度；同時，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH測定吸光度記為ADPPH。按以下 公式計算清除率，并計算白及塊莖和須根的半數抑制率IC5Q;同時，以lmg/mL的沒食子酸為 陽性對照，稀釋20倍，按上述操作，計算沒食子酸的清除率和半數抑制率IC 50;
[0066] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0067] 表1白芨對鐵原子還原能力結果
[0068]
[0070] 實驗研究結果表明，隨著加藥量的增加，吸光度值逐漸增加，還原能力增加，表明 白及塊莖和須根以及陽性對照沒食子酸均是良好的電子供應者，供應的電子可以使體系中 的Fe+還原成Fe} +，還可以與自由基結合成為較為惰性的物質，以中斷自氧化鏈鎖反應，結 果見下表。從實驗結果可以看出，普通方式繁殖的白及與組培方式繁殖的白及對鐵原子還 原能力沒有統計學差異。
[0071] 表2白芨對DPPH自由基清除能力結果
[0072]
[0073]考察白及對DPPH自由基的清除能力，結果發現白及對DPPH具有較強的清除能力， 并呈一定的量效關系。不同繁殖方式得到的白及藥材對DPPH自由基的清除能力沒有統計學 差異。
[0074] 實施例3
[0075] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0076] -種白芨組培快繁方法，具體包括以下步驟：
[0077] S1、外植體滅菌方法:首先用流水沖洗蒴果32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 餾水沖洗3遍，在超凈工作臺上先用75 %酒精消毒3min，再用10 %次氯酸鈉溶液浸泡12min， 期間不停的搖動，使其消毒徹底，無菌水沖洗6遍，無菌濾紙吸干表面水分待用；
[0078] S2、在無菌條件下剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到培養基表 面；
[0079] S3、白芨種子無菌萌發:基本培養基采用MS特殊說明外，均添加蔗糖30L和瓊脂粉 6.5g/L;培養基按試驗設計在滅菌前添加不同的生長調節劑或有機物；
[0080] S4、培養基高溫滅菌前調pH至5.4，121°C下滅菌20min，每處理4次重復；白芨萌發 培養基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球莖、葉片誘導培養基見表1;白芨生根培養基MS+ NAA l.Omg/L;置于光強2000-25001x，光周期16h/8h，溫度27°C的條件下培養；
[00811 在S4中，以MS為基本培養基，添加活性炭0 · 2g/L，瓊脂7 · Og/L，pH 5 · 8，碳源(蔗糖、 葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6個處理，處理1的碳源為蔗糖，用量為30g/L; 處理2的碳源為蔗糖，用量為60g/L;處理3的碳源為葡萄糖，用量為30g/L;處理4的碳源為葡 糖糖，用量為60g/L;處理5的碳源為可溶性淀粉，用量為30g/L:處理5的碳源為可溶性淀粉， 用量為60g/L;每種處理重復30瓶。每次觀察隨機取3瓶，每瓶觀察6個視野，在OLYMPUS SZX-16體式顯微鏡下觀察，并用Canon G12數碼相機拍照保存圖片資料。本發明采用組培瓶規格 為240ml高90mm直徑68mm 口徑62mm，培養基的添加量均為30ml。
[0082] S5、種胚形態及種胚突破種皮過程觀察:接種剩余種子在NIKON ECLIPSE 55i光學 顯微鏡10倍物鏡下觀察種子胚形態和發育狀況，每個蒴果觀察20個視野并統計數據，以有 胚率表示，結果取平均值，有胚率=(有胚的種子數/總種子數）x 100%;
[0083] S6、白芨的組培快繁:將種子無菌萌發誘導的原球莖及葉片切割后，原球莖縱切， 葉片切割長度在〇. 6，分別接種到誘導培養基上，觀察其誘導分化結果；
[0084] S7、用TTC法測定白芨種子活力：活種子的胚在呼吸作用過程中進行氧化還原反 應，而死種子則無此反應；當TTC滲入活種子胚細胞內作為氫受體而被脫氫輔酶(NADH2或 NADPH2)上的氫還原時，無色的TTC轉變為紅色的三苯基甲腙(TTF);如果種胚死亡或種胚生 活力衰退，則不能染色或染色較淺。
[0085]在S7中，所述TTC法測定白芨種子活力的具體過程如下：
[0086] 選擇成熟飽滿的蒴果，將各蒴果種子取出混合均勻，取適量種子加入1.5ml離心管 中至0.25ml刻度處，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用膠頭滴管 吹吸使種子混勻，吸取種子轉移至載玻片上，用濾紙吸去染液，體式顯微鏡下統計種子有胚 率和種子活力，各樣品重復3次;有活力種子胚將被染為橙色或者紅色，無活力種子胚不著 色。
[0087] 本發明還提供一種白芨抗氧化的運用，
[0088]( - )對鐵原子還原能力的影響：
[0089]以lmg/mL沒食子酸為陽性對照，稀釋20后為對照品溶液;分別取供試品溶液和對 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸緩沖溶 液0.5mL，再加1 %鐵氰化鉀0.5mL;混合均勻后，50°C水浴20min;水浴結束后，再每只試管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，離心（3000轉/分鐘）101]1；[11 ;離心結束后，取上清液11]1]^，加入蒸餾 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化鐵;將上述步驟中的藥物換成對應容積的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化鐵改成0. lmL蒸餾水為空白，700nm測定吸光度;平行3份;將上述加入的 藥物換成對應體積的甲醇，按上述方法制備陰性對照；
[0090] (二)對DPPH清除能力的影響：
[0091] 取白及塊莖醇提物稀釋40倍，白及須根醇提物稀釋200倍。然后分別取稀釋液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入適量甲醇至體積為2.425111以即用移液槍精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇為空白，全波長掃描，在最大吸收波 長處測定吸光度；同時，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH測定吸光度記為ADPPH。按以下 公式計算清除率，并計算白及塊莖和須根的半數抑制率IC 5Q;同時，以lmg/mL的沒食子酸為 陽性對照，稀釋20倍，按上述操作，計算沒食子酸的清除率和半數抑制率IC 50;
[0092] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0093] 綜上所述:第一，本發明方法獲得的白芨苗方法簡單，而且大大降低了育苗成本。 本培養方法出芽快，增殖率高，方法簡單，不需要增加組培設備，生產成本低，可批量生產， 應用價值高；
[0094] 第二，白芨的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節、氣候條件與土壤等因素 的制約，可排除病蟲害的侵襲和農藥殘留的影響，嚴格控制白芨的質量；
[0095] 第三使用本發明提供的快繁技術得到白芨幼苗，進行人工栽培，移栽成活率比組 培苗要高，更能快速適應自然環境，能縮短白芨種植年限。
[0096] 以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種白芨組培快繁方法，其特征在于，具體包括以下步驟： 51、 外植體滅菌方法:首先用流水沖洗蒴果26-32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 餾水沖洗2-3遍，在超凈工作臺上先用75 %酒精消毒2-3min，再用10 %次氯酸鈉溶液浸泡8-12min，期間不停的搖動，使其消毒徹底，無菌水沖洗4-6遍，無菌濾紙吸干表面水分待用； 52、 在無菌條件下剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到培養基表面； 53、 白芨種子無菌萌發:基本培養基采用MS特殊說明外，均添加蔗糖30L和瓊脂粉6.5g/ L;培養基按試驗設計在滅菌前添加不同的生長調節劑或有機物； 54、 培養基高溫滅菌前調pH至5.4，121°C下滅菌12-20min，每處理4次重復；白芨萌發培 養基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球莖、葉片誘導培養基見表1;白芨生根培養基MS+NAA l.Omg/L;置于光強2000-25001x，光周期16h/8h，溫度23-27°C的條件下培養； 55、 種胚形態及種胚突破種皮過程觀察:接種剩余種子在NIKON ECLIPSE 55i光學顯微 鏡10倍物鏡下觀察種子胚形態和發育狀況，每個蒴果觀察20個視野并統計數據，以有胚率 表示，結果取平均值，有胚率=(有胚的種子數/總種子數）X 100% ; 56、 白芨的組培快繁:將種子無菌萌發誘導的原球莖及葉片切割后，原球莖縱切，葉片 切割長度在〇. 35-0.6，分別接種到誘導培養基上，觀察其誘導分化結果； 57、 用TTC法測定白芨種子活力：活種子的胚在呼吸作用過程中進行氧化還原反應，而 死種子則無此反應；當TTC滲入活種子胚細胞內作為氫受體而被脫氫輔酶(NADH2或NADPH2) 上的氫還原時，無色的TTC轉變為紅色的三苯基甲腙(TTF);如果種胚死亡或種胚生活力衰 退，則不能染色或染色較淺。2. 根據權利要求1所述一種白芨組培快繁方法，其特征在于:在S7中，所述TTC法測定白 芨種子活力的具體過程如下： 選擇成熟飽滿的蒴果，將各蒴果種子取出混合均勻，取適量種子加入1.5ml離心管中至 0.25ml刻度處，加入1%TTC溶液lml在30°C黑暗放置48h，然后染色48h后，用膠頭滴管吹吸 使種子混勻，吸取種子轉移至載玻片上，用濾紙吸去染液，體式顯微鏡下統計種子有胚率和 種子活力，各樣品重復3次;有活力種子胚將被染為橙色或者紅色，無活力種子胚不著色。3. 根據權利要求1所述一種白芨組培快繁方法，其特征在于:在S4中，以MS為基本培養 基，添加活性炭〇. 2g/L，瓊脂7. Og/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L， 60g/L);共6個處理，處理1的碳源為蔗糖，用量為30g/L;處理2的碳源為蔗糖，用量為60g/L; 處理3的碳源為葡萄糖，用量為30g/L;處理4的碳源為葡糖糖，用量為60g/L;處理5的碳源為 可溶性淀粉，用量為30g/L:處理5的碳源為可溶性淀粉，用量為60g/L;每種處理重復30瓶。 每次觀察隨機取3瓶，每瓶觀察6個視野，在OLYMPUS SZX-16體式顯微鏡下觀察，并用Canon G12數碼相機拍照保存圖片資料。4. 根據權利要求1所述一種白芨組培快繁方法，其特征在于:本發明采用組培瓶規格為 240ml高90mm直徑68mm 口徑62mm，培養基的添加量均為30ml。5. -種權利要求1所述的白芨抗氧化的運用，其特征在于： (一)對鐵原子還原能力的影響： 以lmg/mL沒食子酸為陽性對照，稀釋20后為對照品溶液;分別取供試品溶液和對照品 溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加甲醇至0.31^，各加入?!1 = 6.6的磷酸緩沖溶液 0.5mL，再加1 %鐵氰化鉀0.5mL;混合均勻后，50 °C水浴20min;水浴結束后，再每只試管中加 入10 %三氯乙酸0.5mL，離心（3000轉/分鐘）lOmin;離心結束后，取上清液lmL，加入蒸餾水 lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化鐵;將上述步驟中的藥物換成對應容積的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化鐵改成0. lmL蒸餾水為空白，700nm測定吸光度;平行3份;將上述加入的 藥物換成對應體積的甲醇，按上述方法制備陰性對照； (二)對DPPH清除能力的影響： 取白及塊莖醇提物稀釋40倍，白及須根醇提物稀釋200倍。然后分別取稀釋液0.05、 0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入適量甲醇至體積為2.42511^(即用移液槍精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇為空白，全波長掃描，在最大吸收波 長處測定吸光度；同時，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH測定吸光度記為ADPPH。按以下 公式計算清除率，并計算白及塊莖和須根的半數抑制率IC 5Q;同時，以lmg/mL的沒食子酸為 陽性對照，稀釋20倍，按上述操作，計算沒食子酸的清除率和半數抑制率IC 50; 清除率（％ ) = (Adpph-A|5^)/AdpphX 100% 〇
【文檔編號】A61K36/898GK106035088SQ201610436028
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】黃帥
【申請人】麗江海貝瑞生物科技有限公司