一種西瓜的快速繁殖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種西瓜的快速繁殖的方法，屬于植物組織培養的技術領域。本發明要解決現有西瓜繁殖技術存在再生周期長、基因型限制大的技術問題。本發明方法如下：一、西瓜種子經消毒后浸泡，再播種于營養缽中，待子葉未展開前，去除頂頂芽及側芽；二、將誘導液滴加兩片子葉的連接處，然后培養至直到西瓜莖尖生長點分化處膨大出不定芽為止；三、暗培養；四，光照培養至不定芽叢長出后，轉移到伸長培養基中；五、待不定芽伸長(2.5～3.5)cm，去除不定芽后插到生根培養基中培養，獲得再生植株；六、馴化再生植株。本發明方法的基因型限制小，整個再生周期短，從植株播種到收獲種子，只需3?4個月。
【專利說明】
一種西瓜的快速繁殖的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于植物組織培養的技術領域;具體涉及一種西瓜的快速繁殖的方法。
【背景技術】
[0002] 西瓜（學名：Citrullus lanatus(Thunb · )Matsum. et Nakai)-年生蔓生藤本;莖、 枝粗壯，具明顯的棱溝。果實大型，近于球形或橢圓形，肉質，多汁，果皮光滑，色澤及紋飾各 式。種子多數，卵形，黑色、紅色，兩面平滑，基部鈍圓，通常邊緣稍拱起，花果期夏季。
[0003] 西瓜為夏季之水果，果肉味甜，能降溫去暑;種子含油，可作消遣食品；果皮藥用， 有清熱、利尿、降血壓之效。
[0004] 隨著植物基因工程的發展，農桿菌介導的莖尖轉基因方法的出現使得轉基因技術 有了大突破。莖尖不定芽方法與組培方法相比較，要求環境低、周期短、效率高，可以在較短 時期內獲得大量的植株，對植物功能基因組的研究意義重大。
[0005] 在西瓜遺傳轉化過程中，從外植體的選擇，到染菌除菌、褐化、繼代、篩選劑等各個 環節也都影響最終的轉化效率等。與其他方法相比，莖尖不定芽轉基因方法最大限度的保 持了甜瓜植株的完整性，依賴其自身植株的正常生長，考慮根對激素等敏感性問題，要注意 激素的配比情況，從而達到獲得轉化植株的目的，整個轉化過程脫離了植物組織培養條件 下各種因素的限制。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決現有西瓜繁殖技術存在再生周期長、基因型限制大的技術問題;而 提供了一種西瓜的快速繁殖的方法。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明中一種西瓜的快速繁殖的方法是由下述步驟完成 的：
[0008] 步驟一、西瓜種子經消毒后浸泡，再播種于營養缽中，待子葉未展開前，去除頂頂 芽及側芽；
[0009] 步驟二、將誘導液滴加兩片子葉的連接處，然后培養至直到西瓜莖尖生長點分化 處膨大出不定芽為止；
[0010]步驟三、將步驟二獲得幼苗進行暗培養1~2天；
[0011] 步驟四，然后光照培養至不定芽叢長出后，轉移到伸長培養基中；
[0012] 步驟五、待不定芽伸長(2.5~3.5)cm，去除不定芽后插到生根培養基中培養，獲得 再生植株；
[0013 ]步驟六、馴化再生植株，獲得西瓜再生苗。
[0014] 步驟一中西瓜種子浸泡是將飽滿的西瓜種子在（55~60) °C水中浸泡，并不斷攪 拌，至水溫為室溫，室溫下浸泡12~24h。
[0015] 步驟二中誘導液由l/2MS+0.5mg/L6-BA(6芐基腺嘌呤）+0.05%表面活性劑 5比耶1'-1^77，？!1值為5.7。
[0016] 步驟三暗黑培養是置于25~26°C、黑暗、濕度為80%~90%的條件下培養。
[0017] 步驟四中光照培養:25°C，光照16h/d，黑暗8h/d，光照強度為20001x。
[0018] 步驟四中所述伸長培養基的組成為:MS+0 · 05mg/LBA+0 · Olmg/IAA+7 · 5g/L瓊脂+ 3(^/1鹿糖4田直5.8。
[0019] 步驟五中所述生根培養基的組成為:MS+0 · lmg/LIAA+7 · 5g/lJ京脂+30g/L蔗糖，pH 值5·8〇
[0020] 步驟六中將生根的西瓜苗取出，修剪后栽植到營養土中馴化;所述營養土是由蛭 石與草炭按1:1質量比混合而成的。
[0021] 本發明方法的基因型限制小，整個再生周期短，從植株播種到收獲種子，只需3-4 個月。
【附圖說明】
[0022] 圖1是誘導劑滴加位置示意圖，圖1中箭頭所指的是滴加位置，1表示子葉；
[0023]圖2是【具體實施方式】一中步驟一處理后；
[0024]圖3是【具體實施方式】一中去除胚子葉前端和胚根部分；
[0025]圖4是【具體實施方式】一中步驟二培養后；
[0026]圖5是對比例中1/2MS培養基中培養；
[0027]圖6是對比例中組織培養；
[0028] 圖7是【具體實施方式】一中再生植株的移載成活。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0029] 一：本實施方式中一種西瓜的快速繁殖的方法是由下述步驟完成 的:步驟一、選取西瓜品系100粒飽滿的種子Μ-2,在60°C水中浸泡，并不斷攪拌，至水溫為室 溫，再在室溫下浸泡12h，播種營養缽中，暗培養至50 %種子露白后光照培養5天，待子葉未 展開前，用刀片小心去除頂頂芽及側芽(如圖2);
[0030] 暗黑培養是置于25°C、黑暗、濕度為90 %的條件下培養;光照培養:25°C，光照16h/ d，黑暗8h/d，光照強度為20001x。
[0031] 步驟二、將誘導液滴加兩片子葉的連接處(如圖1所示），然后培養至直到西瓜莖尖 生長點分化處膨大出不定芽為止(圖3);
[0032]誘導液由 l/2MS+1.0mg/L6-BA(6 芐基腺嘌呤）+0.05%表面活性劑310^1'-1^77，？!1 值為5.7。
[0033]步驟三、將步驟二獲得幼苗進行暗培養1~2天；
[0034]暗黑培養是置于25°C、黑暗、濕度為90%的條件下培養。
[0035]步驟四，然后光照培養至不定芽叢長出后，轉移到伸長培養基中（圖4);
[0036] 光照培養:25°C，光照16h/d，黑暗8h/d，光照強度為20001x;所述伸長培養基的組 成為:MS+0 · 05mg/LBA+0 · 0 lmg/LIAA+7 · 5g/L 瓊脂+30g/L 蔗糖，pH值5 · 8。
[0037]步驟五、待不定芽伸長3.0cm，去除不定芽后插到生根培養基中培養，獲得再生植 株(圖5);
[0038]所述生根培養基的組成為:MS+0· lmg/LIAA+7 · 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5·8。
[0039] 步驟六、將生根的西瓜苗取出，修剪后栽植到營養土（以質量計，蛭石:草炭= 1:1) 中馴化，獲得西瓜再生苗，2周后與實生苗長勢相同（圖7)。
[0040] 采用下述試驗驗證發明效果：
[0041] 試驗一、不同西瓜品種不定芽誘導的影響
[0042] 誘導液由 l/2MS+1.0mg/L6-BA(6 芐基腺嘌呤）+0.05%表面活性劑310^1'-1^77，？!1 值為5.7。
[0043]處理方法:每個處理設3次重復，每次重復10個外植體。培養條件:溫度25°C，光照 16h/d，黑暗8h/d，光照強度為20001x。每7~10d繼代一次，30d后統計不定芽數目，計算再生 頻率和每外植體再生芽數。
[0044] 結果如表1所示：
[0045] 表1不同基因型萌發率和分化率比較
[0046]
[0047] 由表1可知，本申請的誘導劑配方對不同品種的西瓜均有效果
[0048] 試驗二、不同誘導劑不定芽誘導的影響
[0049] 采用不同誘導劑對西瓜W-1品種進行處理，處理方法同試驗一，不同誘導劑的配方 如表2所述，結果見表3。
[0050] 表2不同誘導劑配方表
[0051]
[0052] 表3不同激素濃度產生不定芽數目的比較(W-1品種）
[0053]
[0054] 由表3可知，配方3誘導劑(即【具體實施方式】一所述的誘導劑)的效果最佳。
[0055] 試驗三、不同繁殖方法子葉節組織培養試驗
[0056]對比例：西瓜繁殖方法的步驟如下：
[0057] (1)取材滅菌，將西瓜種子剝去殼后。用70 %酒精滅菌30s，再用0.05 %升汞消毒10 分鐘，在超凈工作臺上用滅菌水洗3 - 4次。每次泡1分鐘，接種到1/2MS培養基中，獲得多個 苗，5天后（圖5)，獲得無菌苗，然后用刀片去除胚子葉前端，接種到啟動培養基中。
[0058] (2)啟動培養，將滅菌后切好的胚塊放在啟動培養基中培養。首先在28 °C下暗培養 2d，然后至人工氣候箱培養，培養條件為白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照強 度為2000Lx，光照條件，培養10天。培養基組成為1/8MS+BA1.5mg/L+IAA0. lmg/L，瓊脂中（其 中每升含蔗糖30g、瓊脂7.5g，pH值5.8)，培養時間為10d，獲得啟動培養胚塊(圖6)。
[0059] (3)不定芽培養，將步驟(2)所得的所得的啟動培養胚塊均勻切成四小塊，并轉移 到不定芽培養基中培養，培養條件為：白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照強度 為2000Lx，培養時間為20天，獲得不定芽培養胚塊；
[0060] 其中不定芽培養基組成為:MS基本培養基+BA1 · 0mg/L+IAA0 · lmg/L+7 · 5g/L瓊脂+ 30g/L蔗糖，pH5.8，然后轉移到MS+BA1.0mg/L+IAA0. lmg/L見有不定芽叢長出后，轉移到伸 長培養基中MS+0.05mg/L ΒΑ+ΙΑΑ0. lmg/L。
[0061] (4)伸長培養，將啟動培養獲得的胚塊均勻切成四小塊，轉移到伸長培養基中培養 (圖5)。培養條件為：白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照強度為2000Lx，培養20 天，獲得伸長培養胚塊。
[0062] (5)去除步驟(4)所得伸長胚塊中長于3cm的不定芽并移植到生根培養基中，培養 條件為：白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照強度為2000Lx光照條件，培養10 天，獲得再生植株；
[0063]所述生根培養基，組成是:MS基本培養基+ΙΑΑ0 · lmg/L+7 · 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖， pH5.8〇
[0064] (6)再生植株馴化，將生根的西瓜苗取出，適當修剪，然后栽植到營養土蛭石:草炭 =1:1中，注意保溫保濕，2周后與實生苗長勢相同。
[0065] 對【具體實施方式】一和對比例所提供的方法的效果進行了測定。對西瓜再生植株培 育過程中，繁殖系數、再生頻率、外植體再生芽數及培植周期進行了測定和統計，結果見表 1〇
[0066] 表1不同方法培植再生植株的效果
[0067]
[0068] 從表1可知，本發明所提供的方法在繁殖系數、再生頻率及外植體再生芽數方面明 顯優于對比例，而培植周期卻比傳統方法短13天。
【主權項】
1. 一種西瓜的快速繁殖的方法，其特征在于該繁殖方法是由下述步驟完成的： 步驟一、西瓜種子經消毒后浸泡，再播種于營養缽中，待子葉未展開前，去除頂頂芽及 偵U芽； 步驟二、將誘導液滴加兩片子葉的連接處，然后培養至直到西瓜莖尖生長點分化處膨 大出不定芽為止； 步驟三、將步驟二獲得幼苗進行暗培養1~2天； 步驟四，然后光照培養至不定芽叢長出后，轉移到伸長培養基中； 步驟五、待不定芽伸長(2.5~3.5)cm，去除不定芽后插到生根培養基中培養，獲得再生 植株； 步驟六、馴化再生植株，獲得西瓜再生苗。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟一中西瓜種子浸泡是將飽滿的西瓜種 子在(55~60)°C水中浸泡，并不斷攪拌，至水溫為室溫，室溫下浸泡12~24h。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟二中誘導液由1/2MS+0.5mg/L6-BA+ 0.05 % 表面活性劑SILWET-L77，pH 值為5.7。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟三暗黑培養是置于25~26°C、黑暗、濕 度為80 %~90 %的條件下培養。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟四中光照培養:25°C，光照16h/d，黑暗 8h/d，光照強度為20001x。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟四中所述伸長培養基的組成為:MS+ 0 · 05mg/LBA+0 · Olmg/IAA+7 · 5g/L 瓊脂+30g/L 蔗糖，pH值5 · 8。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟五中所述生根培養基的組成為:MS+ 0. lmg/LIAA+7.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟六中將生根的西瓜苗取出，修剪后栽植 到營養土中馴化。9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于營養土是由蛭石與草炭按1:1質量比混合而 成的。
【文檔編號】A01H4/00GK106035082SQ201610381713
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】張慧君, 宋運賢, 杜雪玲
【申請人】淮北師范大學