一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法

一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法
【專利摘要】本發明涉及生物領域，公開了一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法，通過移植不同數量級的血液腫瘤細胞和實體腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠模型內，構建腫瘤小鼠模型后，檢測腫瘤小鼠模型內外周血中腫瘤細胞GPB的比例、骨髓中腫瘤細胞GBM的比例、以及脾臟中腫瘤細胞GSP的比例，根據所述比例參數指標評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度，本發明的優點在于，可以定量評價免疫缺陷小鼠的缺陷程度，其中涉及簡化和總結通過腫瘤移植效率與小鼠免疫缺陷程度之間的聯系而獲得的數學模型和計算方法，并且可通過免疫缺陷程度得分以比較免疫缺陷小鼠之間的缺陷差異程度。本發明所述方法簡單易行，便于操作，具有良好的應用前景。
【專利說明】
一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物領域，特別涉及一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方 法。
【背景技術】
[0002] 以免疫缺陷小鼠為宿主，構建的人源化小鼠模型和病人來源的異種移植模型是人 體免疫系統和人體腫瘤病理機制研究的重要工具。1963年，科學家研發出裸鼠 （Nude mice)，該小鼠 Foxnl基因突變，胸腺惡化或缺失，阻斷T細胞發育，導致T細胞大量劇減，免疫 系統缺陷。但裸鼠擁有B細胞和自然殺傷(NK，natural ki 1 ler)細胞，不利于維持人體細胞 在小鼠體內的生長。1983年，嚴重復合免疫缺陷小鼠（scid，severe combined immunodeficiency)出現，該小鼠 Prdkc基因缺陷，導致其缺失B細胞和T細胞。RAG2小鼠 (recombination activating 2deficient)Rag2基因缺失，Β細胞和Τ細胞缺失。與scid小鼠 一樣，RAG2小鼠仍然存在大量的NK細胞，一定程度上限制了人體細胞的移植。1995年，研究 人員通過將Prdkcscid基因突變導入NOD(non-obese diabetic)近交系小鼠，建立NOD-scid (NOD. Cg-Prkdcscid)小鼠。該小鼠不僅缺失B細胞和T細胞，且僅有少量的NK細胞，固有免疫 系統損傷，是免疫缺陷小鼠的一個里程碑。而人源化小鼠構建的一個重要的突破是 I12Rg-/_小鼠及基于該小鼠的其它免疫缺陷小鼠的研發，如N0G(N0D/Shi-Prkdcseid I12rctmlSug/Jic)、NSG(N0D/LtSz-PrkdcscidI12rc tmlWjl/J).IL2Rc 是 IL-2、IL-4、IL-7、IL-15 和IL-21細胞因子的共有受體，而這些細胞因子對T、B、NK等免疫細胞的發育具有重要的影 響。所以，IL2Rc-/-免疫缺陷小鼠缺失Τ、B、NK細胞，同時該小鼠的巨噬細胞和樹突狀細胞功 能被削弱。與其他免疫缺陷小鼠對比，NOG、NSG小鼠表現出高水平的移植供體特性:在這兩 種IL2R γ c缺陷小鼠品系中，人造血干細胞移植表現出極高的移植效率，并且這些造血干細 胞可分化為多種造血系細胞，如CD4和CD8單陽Τ細胞;移植的癌細胞在該小鼠中能快速生長 并在多次傳代后保持低分化的特性。但盡管免疫缺陷小鼠及其相關研究越來越多，但是缺 乏統一的標準對免疫缺陷小鼠進行評估，則導致進一步的免疫缺陷小鼠研究和應用缺乏參 考和指導的標準。
[0003] 免疫系統是生物體體內一系列的生物學結構和進程所組成的疾病防御系統，無法 用單一的或簡單組合的免疫指標如Τ、Β、ΝΚ細胞數量或者干擾素、趨化因子等表達情況來判 定免疫強度。同理，小鼠免疫缺陷程度也無法通過這些單一或簡單組合的免疫細胞或炎癥 因子的缺陷來評估。
[0004] 在腫瘤微環境中，腫瘤細胞和機體的免疫系統相互作用，相互影響。大量的臨床數 據表明免疫缺陷的個體更容易自發腫瘤。比如，跟沒有免疫缺陷的病人對比，有免疫缺陷的 病人更傾向于得白血病。跟免疫缺陷的病人相似，免疫缺陷小鼠患自發腫瘤的概率比免疫 系統正常的小鼠高很多。因此，在免疫缺陷小鼠體內，免疫系統的極度缺陷會導致很大程度 的腫瘤增殖。腫瘤免疫是廣泛動員機體免疫系統對抗腫瘤生長和發育的過程，所以基于腫 瘤移植的小鼠免疫缺陷程度評估是全面的。腫瘤免疫包括清除、平衡和逃逸三個主要階段。 而清除階段又可細分為四個階段，一:起始抗腫瘤免疫應答，內在免疫系統的免疫細胞識別 正進行基質重塑，引起組織損傷的腫瘤細胞。接著，通過釋放炎癥信號征召和集合內在免疫 系統的免疫細胞，如自然殺傷細胞（NK)、自然殺傷T細胞(NKT)巨噬細胞和樹突狀細胞。集 結而來的NK細胞和NKT細胞釋放α干擾素（IFN-α)。二:α干擾素效應，新合成的α干擾素可誘 導腫瘤凋亡，并促進趨化因子CXCL10、CXCL9和CXCL11的產生。這些趨化因子可以通過阻斷 新血管的生成而抑制腫瘤生長。更多的免疫細胞將受趨化因子趨化、集結在腫瘤部位。這階 段，樹突狀細胞吞噬腫瘤細胞后，將迀移至淋巴結。三:擴大效應，ΝΚ細胞和巨噬細胞通過釋 放α干擾素和IL-12相互激活。這些細胞將進一步促進腫瘤凋亡和活性氧、氮中間體的產生。 在淋巴結中，吞噬腫瘤后的腫瘤特異性樹突狀細胞可啟動輔助性Τ細胞的分化，接著促進腫 瘤殺傷性Τ細胞即CD8+T細胞的發育。四：特異性清除，發育成熟的腫瘤特異性CD4+T細胞和 CD8+T細胞迀移至腫瘤部位，并殺傷仍存留的抗原耐受的腫瘤細胞。平衡階段和逃逸階段， 腫瘤細胞突變體在清除階段中存活下來，并進入平衡階段。在平衡階段，淋巴細胞和α干擾 素會給予選擇性清除壓力，腫瘤細胞會進行基因突變以適應，并進入逃逸階段。腫瘤免疫廣 泛涉及固有免疫和適應性免疫的范圍，基于腫瘤移植模型的免疫缺陷程度評估可全面反映 小鼠免疫缺陷程度。異種移植的腫瘤細胞相對更難適應免疫壓力的機體環境，同種結合異 種的腫瘤移植模型評估可更真實的反映小鼠免疫缺陷程度。
[0005] 現今，伴隨著各種新型大規模基因敲除技術和基因組修飾工具的出現，如TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)和Cas(Type II Clustered, Regularly Interspaced,Short Palindromic Repeat(CRISPR)associated system)技術 等，構建各種免疫缺陷小鼠品系的效率不斷地提高。本發明人也利用TALEN技術，成功在 NOD-sc id小鼠品系背景下，敲除IL2Rc基因，獲得NOD-scid IL2Rg-/_(NSI)小鼠品系（專利 申請號：CN201310229629)。然而，隨著免疫缺陷小鼠的不斷出現，目前仍沒有一個評估小 鼠免疫缺陷程度的標準方法，很難客觀地評估基因修飾小鼠品系的免疫缺陷程度，將導致 免疫缺陷小鼠的盲目構建和使用，也不利于免疫缺陷小鼠應用的標準統一和推廣。

【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的 方法，其實現的目的是根據本發明方法可量化免疫缺陷小鼠的免疫缺陷程度，從而通過該 方法可以簡單、準確地得到腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠模型的作用，進而能夠較好的應用在 構建免疫缺陷小鼠模型中。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為，本發明公開的一種評價免疫缺陷小 鼠模型的免疫缺陷程度的方法，包含以下步驟：
[0008] 通過移植不同數量級的血液腫瘤細胞和實體腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠模型內，構 建腫瘤小鼠模型后，檢測腫瘤小鼠模型內外周血中腫瘤細胞GPB的比例、骨髓中腫瘤細胞 GBM的比例、以及脾臟中腫瘤細胞GSP的比例，根據所述比例參數指標評價免疫缺陷小鼠模 型的免疫缺陷程度。
[0009] 進一步的，所述腫瘤細胞為同種或異種種，采用本發明方法不僅可以評價動物源 腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作用，還可以用于評價人源化的腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作 用。
[0010] 進一步的，腫瘤細胞移植的不同數量級為L: 1 X 104個，Μ: 1 X 105個，Η: 1 X 106個，該 數量級的選擇基于低于該數量級，則無法得到腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠模型的作用指標， 高于該數量級，腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠模型小鼠作用難以區分開。
[0011] 本發明專利提供了一種量化免疫缺陷小鼠品系免疫缺陷程度的方法，為免疫缺陷 小鼠的評估提供標準，以及幫助科研人員挑選合適的小鼠提供依據，并且為免疫缺陷小鼠 研究和應用提供參考和指導的標準。
[0012] 具體應用如，協助科研人員定義和評估新研發的免疫缺陷小鼠；為科研人員選擇 免疫缺陷小鼠開展動物實驗提供依據;為科研人員利用免疫缺陷小鼠的動物實驗結果分析 提供合理參考;為評估不同免疫缺陷小鼠的相關免疫能力提供一種可參考的數學模型和實 驗設定。
[0013] 本發明人根據腫瘤免疫對免疫系統的廣泛涉及程度，提出通過在小鼠中移植同種 或異種的腫瘤細胞，觀察小鼠機體對同種或異種腫瘤細胞的排斥程度，以此反映小鼠的免 疫缺陷程度。所述腫瘤細胞優選為人源的腫瘤細胞，其中人血液腫瘤細胞優選為人慢性髓 系白血病Κ562細胞系，人實體腫瘤細胞優選為人肺癌Α549細胞系；更優選地，所述腫瘤細胞 為鼠源腫瘤細胞，血液腫瘤細胞優選小鼠淋巴瘤細胞系RMA，實體腫瘤細胞優選小鼠黑色素 瘤細胞系B16-F10。
[0014] 進一步的，根據檢測得到的腫瘤小鼠模型內外周血中腫瘤細胞GPB的比例、骨髓中 腫瘤細胞GBM的比例、以及脾臟中腫瘤細胞GSP的比例，評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷 程度的方法包括如下步驟，（1)采用公式得到移植每個數量級血液腫瘤細胞對免疫缺陷小 鼠的作用指數ΗΤΕI，Gi為GPB、GBM、GSP之和，Di為將血液腫瘤細胞移植入免疫 缺陷小鼠模型內到腫瘤細胞開始對免疫缺陷小鼠模型作用間隔的時間，分別得到每個數量 級血液腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作用指數ΗΤΕΙ (Η)，HTEI (M)，HTEI (L)，最后再求得平均 HTEI；
[0015] (2)采用公式得到移植每個數量級實體腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠模型的作用指數 m STEI，Sr￡/=y，Wn為將實體腫瘤移植入免疫缺陷小鼠模型內形成的實體腫瘤的重量，Dn L.hi 為將實體腫瘤移植入免疫缺陷內到腫瘤細胞開始對免疫缺陷小鼠模型作用的間隔時間，分 別得到每個數量級實體腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作用指數STEI(H)，STEI(M)，STEI(L)， 最后再求得平均STEI;
[0016] (3)根據步驟（1)和步驟(2)得到的平均HTEI、平均STEI，采用如下公式得到總腫瘤 作用指數??/*^^胃 6該總腫瘤作用指數與免疫缺陷程度呈負相關。
[0017] 本發明首次提出一個量化小鼠的免疫缺陷程度的數學模型和計算方法，通過這個 數學模型，可以定量地獲得免疫缺陷小鼠的缺陷程度程度。并且，通過對比免疫缺陷程度得 分可以評估免疫缺陷小鼠之間的缺陷差異程度。研究人員可以利用這個數學模型，挑選出 合適的免疫缺陷小鼠來進行特定的實驗。
【附圖說明】
[0018] 圖1為7種小鼠免疫缺陷程度柱狀圖；
[0019] 圖2顯示7種小鼠同種腫瘤免疫缺陷程度柱狀圖。
【具體實施方式】
[0020] 本發明公開了一種量化小鼠免疫缺陷程度的方法，本領域技術人員可以借鑒本文 內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例 進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應 用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0021] 實施例一:具體實施步驟：
[0022] 帶標記基因的人血液瘤細胞系的構建
[0023]為了便于本發明創造的推廣和應用，以人慢性髓系白血病細胞系K562作為免疫缺 陷數學模型的標準(異種)人血液腫瘤細胞，以人肺腺癌細胞系A549作為免疫缺陷數學模型 的標準（異種）人實體腫瘤細胞，并在K562細胞系中導入標記基因（如GFP綠色熒光基因、 Tdtomato紅色熒光基因、Luciferase熒光酶等）。以下介紹GFP綠色熒光基因轉染方法，包裝 Lenti-GFP病毒感染腫瘤細胞系，擴大培養被感染細胞后，分選感染成功的GFP陽性腫瘤細 胞，獲得GFP陽性細胞純度大于98 %。
[0024] 血液瘤小鼠模型的構建和HTEI的計算
[0025] 將不同數量級（106(田，105(1〇，104(〇)帶標記基因的血液瘤細胞系(1(562-6??)移 植入待評估的特定免疫缺陷品系實驗小鼠（每一數量級移植用5只實驗小鼠），移植腫瘤細 胞后，每天觀察小鼠狀態。小鼠病發時，記錄小鼠的存活時間(D〇以及小鼠血液、脾臟、骨髓 中的腫瘤細胞(GFP陽性細胞）比例(6^6^"采用如下公式分別計算出每個數量級的 HTEI(H)，HTEI(M)，HTEI(L)，
[0026]
i為Gpb、Gbm、Gsp之和，要注意的是，Gi、Di均是平行重復試驗多次得到 的平均值，本次實施例采用了5只小鼠平行重復試驗5次，最后得到，再根據HTEI(H)，HTEI (Μ)，HTEI(L)求得平均HTEI;
[0027] 實體瘤小鼠模型的構建和STEI的計算
[0028]移植不同數量級（106(扣，105(1〇，104(〇)實體瘤細胞系(4549移植入待評估的特 定免疫缺陷品系實驗小鼠（每一數量級移植用5只實驗小鼠），移植腫瘤細胞后，每天觀察小 鼠狀態。移植人實體腫瘤細胞系一定時間后(不同腫瘤細胞系的觀察時間不同，A549細胞系 則于移植三十天后進行觀察記錄），稱量并記錄形成的實體腫瘤的質量(Wn，單位:g)，并將 Dn = 30和Wn代入公式
分別求出STEI(H)，STEI(M)，STEI(L)，最后求得平均 STEI〇
[0029] 評估該品系小鼠的免疫缺陷程度
[0030] 將前述步驟計算出來的平均ΗΤΕI和平均STEI待入公式
最后計算出該品系免疫缺陷小鼠模型總腫瘤作用指數TEI，該指數和免疫缺陷程度呈負相 關。
[0031] TEI數值越高，則表示該品系小鼠的免疫缺陷程度越嚴重;TEI數值越低，表示該品 系小鼠的免疫系統越完整。以上闡述的方法是綜合評估小鼠免疫缺陷程度的，對于具體的 免疫系統情況，如T細胞或B細胞或NK細胞的數量和功能、針對HIV病毒感染的免疫系統缺陷 程度等，TEI僅能提供參考作用；
[0032] 對于具體免疫系統情況評估，同樣可以運用上述公式中介紹的數學模型結合動物 模型的方法進行評估，僅需對實驗設定如腫瘤移植實驗、腫瘤細胞、移植數量級、獲取評估 參數等作一定的修改即可。
[0033] 實施例二：
[0034] 利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估NSI(N0D-scid IL2rg-/_)小鼠 的免疫缺陷程度(TEInsi)，具體步驟如下：
[0035] 1 · 1 .HTEInsJ^值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入NSI小鼠體內，每 天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0036] 表1 .NSI小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表
[0037]
[0038]將以上參數代入公式得：
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] HTElNsi = average(HTEI(Nsi,H)，HTEI(Nsi,M)，TEI(nsi,l)) = 0.014
[0043] 1.2.STEINSJi值計算：分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入NSI小鼠體內，每 天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0044] 表2.NSI小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表
[0045]
[0046] 將以上參數代入公式得：
[0050] STEInsi = average (STEI(nsi, h)，STEI (nsi,m)，STEI (nsi,L)) = 0 · 040[0051 ] 1 · 3 · NSI小鼠免疫缺陷程度的評估，TEINSIm值計算：[0052] 將以上獲得的HTEINsdPSTEINSI的數值代入公式得
[0047]
[0048]
[0049]
[0053]
[0054]由上可得，NSI小鼠的免疫缺陷程度得分為0.027。
[0055] 實施例三
[0056]利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估NOD-scid(簡寫:NS)小鼠的免疫 缺陷程度(TEIns)，具體步驟如下：
[0057] 1.4. HTEIns數值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入NOD-scid小鼠體 內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0058] 表3.NOD-scid小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表
[0059]
[0060] 將以上參數代入公式得：
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] HTEIns = average (HTEI (ns, h) )，HTEI (ns,m)，TEI (ns, L)) = 0 · 009
[0065] 1.5. STEIns數值計算：分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入NOD-scid小鼠體 內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0066] 表4.NOD-scid小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表
[0067]
[0068]將以上參數代入公式得：
[0069]
[0070]
[0071]
[0072] STEIns = average (STEI (ns, h) , STEI (ns,m) , STEI (ns, l) ) = 0.023
[0073] 1.6.N0D-scid小鼠免疫缺陷程度的評估，TEIns數值計算：
[0074] 將以上獲得的HTEIns和STEIns的數值代入公式，得
[0075]
[0076]由上可得，NOD-scid小鼠的免疫缺陷程度得分為0.016。
[0077] 2.實施例四：
[0078]利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估CB-17scid(簡寫：scid)小鼠的 免疫缺陷程度(TEIwd)，具體步驟如下：
[0079] 2.1 .HTEIscid數值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入CB-17scid小鼠 體內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0080] 表5. CB_17scid小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表 「00811
[0082]將以上參數代入公式得：
[0083]
[0084]
[0085]
[0086] HTEIscid = average(HTEI(scid,H)，HTEI(scid,M)，TEI(scid,L)) =0.001
[0087] 2 · 2 · STEIscid數值計算：分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入CB-17scid小鼠 體內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0088] 表6. CB_17scid小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表
[0089]
[0091 ]將以上參數代入公式得：
[0095] STEIscid = average(STEI(scid,H) ,STEI(scid,M),STEI(scid,L))=0.011[0096] 2.3. CB-17scid小鼠免疫缺陷程度的評估，TEIscid數值計算：[0097] 將以上獲得的HTEIscid和STEIscid的數值代入公式，得
[0092]
[0093]
[0094]
[0098]
[0099]由上可得，CB-17scid小鼠的免疫缺陷程度得分為0.006。
[0100] 3.實施例五：
[0101] 利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估IL2rg-/_(簡寫：IL2)小鼠的免疫 缺陷程度(TEIIL2)，具體步驟如下：
[0102] 3.1.HTEIIL2數值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入IL2rg-/_小鼠體 內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0103] 表7. IL2rg-/_小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表
[0104]
[0105] 將以上參數代入公式得：
[0106]
[0107]
[0108]
[0109] HTEIiL2 = average(HTEI(iL2,H)，HTEI(iL2,M)，TEI(il2,l)) = 0.0003
[0110] 3.2. STEIIL2數值計算:分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入IL2Rg-/_小鼠體 內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0111] 表8. IL2Rg-/_小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表
[0112]
[0114]將以上參數代入公式得：
[0115]
[0116]
[0117]
[0118] STEIil2 = average (STEI(il2, η)，STEI (il2,m)，STEI (il2l) ) = 0 · 002
[0119] 3.3. IL2Rg-/_小鼠免疫缺陷程度的評估，TEIIL2數值計算：
[0120] 將以上獲得的ΗΤΕIIL2和STEIIL2的數值代入公式得
[0121]
[0122] 由上可得，IL2Rg_/_小鼠的免疫缺陷程度得分為0.001。
[0123] 4.實施例六：
[0124] 利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估Rag2-/_(簡寫:Rag2)小鼠的免疫 缺陷程度(TEIRag2)，具體步驟如下：
[0125] 4.1 .HTEIRag2數值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入Rag2-/_小鼠體 內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0126] 表9 .Rag2_/_小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表
[0127]
[0128] 將以上參數代入公式得：
[0129]
[0130]
[0131]
[0132] HTElRag2 = average(HTEI(Rag2,η) ,HTEI(Rag2,M) ,TEI(Rag2,L)) =0.000
[0133] 4.2.STEIRag2數值計算：分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入Rag2-/-小鼠體 內，每天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0134] 表10.Rag2-/_小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表
[0135]
[0136] 將以上參數代入公式得：
[0137]
[0138]
[0139]
[0140] STElRag2 = average(STEI(Rag2,H) ,STEI(Rag2,M) ,STEI(Rag2,L)) =0.005
[0141] 4.3. Rag2_/_小鼠免疫缺陷程度的評估，TEIRag2數值計算：
[0142] 將以上獲得的HTEIRag2和STEIRag2的數值代入公式得
[0143]
[0144] 由上可得，Rag2_/_小鼠的免疫缺陷程度得分為0.0025。
[0145] 5.實施例七
[0146] 利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估nude(簡寫:Nu)小鼠的免疫缺陷 程度(TEINu)，具體步驟如下：
[0147] 5.1. HTEINu數值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入nude小鼠體內，每 天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0148] 表11 .nude小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表
[0149]
[0150]將以上參數代入公式得：
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] HTElNu = average(HTEI(Nu,H)，HTEI(nu,m),TEI(nu,l)) =〇·〇〇〇
[0155] 5.2. STEINJi值計算：分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入nude小鼠體內，每 天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0156] 表12.nude小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表
[0157]
[0159]將以上參數代入公式得：
[0160]
[0161]
、、χ·-·_ *.[0163] STEInu = average (STEI (Nu, η)，STEI (nu,m)，STEI (Nu, l) ) = 0 · 008[0164] 5.3. nude小鼠免疫缺陷程度的評估，TEINlJ^值計算：[0165] 將以上獲得的HTEINl^STEINu的數值代入公式1，得
[0162]
[0166]
[0167] 由上可得，nude小鼠的免疫缺陷程度得分為0.004。
[0168] 6.實施例八：
[0169] 利用本發明小鼠免疫程度評估的方法，綜合評估C57BL/6(簡寫:B6)小鼠的免疫缺 陷程度(TEIB6)，具體步驟如下：
[0170] 6.1.HTEIB6數值計算：分別移植H、M、L數量級的K562-GFP細胞入nude小鼠體內，每 天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0171] 表13. C57BL/6小鼠-人血液腫瘤移植模型參數表
[0172]
[0173] 將以上參數代入公式得：
[0174]
[0175]
[0176]
[0177] HTElB6 = average(HTEI(Nu,H)，HTEI(nu,m)，TEI(nu,l)) =0 ·000
[0178] 6.2. STEIB6數值計算：分別移植H、M、L數量級的A549-GFP細胞入nude小鼠體內，每 天觀察小鼠，于小鼠病發時獲取并記錄實驗參數如下表：
[0179]表14. B6小鼠-人實體腫瘤移植模型參數表 [0180]
[0182] 將以上參數代入公式得：
[0186] STEIB6 = average (STEI (B6, h)，STEI (B6,M)，STEI (B6, L)) = 0 · 〇〇〇[0187] 6.3. B6小鼠免疫缺陷程度的評估，TEIB6數值計算：[0188] 將以上獲得的HTEIB6和STEIB6的數值代入公式得
[0183]
[0184]
[0185]
[0189]
[0190] 由上可得，B6小鼠的免疫缺陷程度得分為0.000。
[0191 ]由實施例二到八可知，七種品系小鼠的免疫缺陷程度對比（如下圖）S:NSI>N0D-scid>scid>nude>Rag2-/->IL2rg-/->C57BL/6(WT)，這為研究人員動物模型構建實驗 選擇合適的免疫缺陷小鼠提供了重要的參考依據；同時，由圖1可知，NSI小鼠擁有最強的免 疫缺陷程度，因此在研究人員研發新型免疫缺陷小鼠時，應以NSI小鼠作為對照標準評估新 研發小鼠品系的免疫缺陷程度。
[0192] 7.實施例九
[0193] 因抵抗、殺傷異種移植的腫瘤細胞將更大程度的動用免疫系統，所以可通過腫瘤 異種移植結合數學模型的方法(如以上闡述），綜合評估小鼠的免疫缺陷程度。而需要對某 一特定功能、某一特定免疫細胞等免疫缺陷程度的評估，則需對腫瘤移植模型試驗和相對 應的數學模型進行一定的修改，以評估某特定免疫系統缺陷程度，如本實施例一一利用腫 瘤同種移植模型結合數學模型的方法，評估腫瘤同種移植的免疫缺陷程度。詳細如下：
[0194] 8.1數學模型參數含義修改：
[0? 95] HTEI (strain, allograft)，同種血液瘤移植能力得分，表示待評估的某品系（Strain )小 鼠移植小鼠血液瘤細胞重建血液腫瘤(Hemato 1 ogic Tumor)的能力得分，在此以小鼠淋巴 瘤細胞系RMA移植為標準。
[0196] 同種實體瘤移植能力得分，表示待評估的某品系（Strain)小鼠移植小鼠實體瘤細 胞重建實體腫瘤(Solid Tumor)的能力得分，在此以小鼠黑色素瘤細胞系B16-F10為標準。
[0197] 表示某品系(Strain)小鼠同種腫瘤移植能力得分，以此評估該品系小鼠對同種腫 瘤的免疫缺陷程度。
[0198] 8.2具體實施步驟：
[0199] 8.2.1帶標記基因的小鼠血液瘤細胞系的構建
[0200] 在RMA細胞系中導入標記基因（如GFP綠色熒光基因、Tdtomato紅色熒光基因、 Lucif erase熒光酶等）。以下以GFP綠色熒光基因為例介紹標記基因導入方法，包裝Lenti-GFP病毒感染腫瘤細胞系，擴大培養被感染細胞后，分選感染成功的GFP陽性腫瘤細胞，獲得 GFP陽性細胞純度大于98%。
[0201] 8.2.2血液瘤小鼠模型的構建和HTEIstrain的計算
[0202] 將不同數量級（106(田，105(1〇，104(〇)帶標記基因的血液瘤細胞系（1?^-6??)移 植入待評估的特定免疫缺陷品系實驗小鼠（每一數量級移植用5只實驗小鼠），移植腫瘤細 胞后，每天觀察小鼠狀態。小鼠病發時，記錄小鼠的存活時間(Dn)以及小鼠血液、脾臟、骨髓
中的腫瘤細胞(GFP陽性細胞)比例(Gpb、Gsp、Gbm)，并代人公另 計算出
[0203] 8.2.3實體瘤小鼠模型的構建和STEIstrain的計算
[0204] 移植不同數量級（106(!〇，105(1〇，104(〇)實體瘤細胞系(816?1〇-6??)移植入待評 估的特定免疫缺陷品系實驗小鼠（每一數量級移植用5只實驗小鼠），移植腫瘤細胞后，每天 觀察小鼠狀態。移植人實體腫瘤細胞系一定時間后（不同腫瘤細胞系的觀察時間不同， B16F10細胞系則于移植二十天后進行觀察記錄），稱量并記錄形成的實體腫瘤的質量(Wn， 單位:g)，并將Dn=2(^PWn代入公?
,計算出
[0205] 8.2.4評估該品系小鼠的免疫缺陷程度TEIstrain
[0206] 將上述計算出來的和待入公￥
，最后計算出該品系小 鼠同種腫瘤移植能力得分，并將該數值定義為該品系小鼠對同種腫瘤的免疫缺陷程度。 [0207] 8.2.5評估7種品系小鼠的同種腫瘤移植能力得分
[0208]通過本發明方法，分別獲取 NSI、IL2rg-/-、N0D-scid、scid、Rag2-/-、nude、C57BL/ 6七種小鼠的H、M、L移植數量級的HTEI和STEI數值，并最后求出不同品系的TEIaiiogrrft得分 (如表15和圖2)。
[0209]表15.同種腫瘤免疫缺陷程度TEI [0210]
[0211] 由實施例九結果可得，對同種腫瘤的免疫缺陷程度對比為:NSI>IL2rg-/->N0D-scid>scid>Rag2-/->nude>C57BL/6(WT)，NSI小鼠對同種腫瘤移植的免疫缺陷程度最高。
[0212] 同種，腫瘤免疫缺陷程度的高低排序與綜合免疫缺陷程度大致相同，可見，綜合免 疫缺陷程度的評估對小鼠特定免疫系統缺陷程度評估具有一定的參考價值。
[0213] 識別和殺傷同種腫瘤更多需要動用固有免疫系統特別是NK自然殺傷細胞，而 IL2rg-/_和Rag2-/_小鼠的NK細胞缺陷程度更高，所以IL2rg-/_和Rag2-/_小鼠的同種腫瘤 免疫缺陷程度排序相對向前移動。由此可知，動物實驗結合數學模型的方法不僅可用于綜 合免疫缺陷程度的評估，而且可準確評估小鼠的特定免疫系統缺陷程度。
[0214] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種評價免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法，包含以下步驟： 通過移植不同數量級的血液腫瘤細胞和實體腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠模型內，構建腫 瘤小鼠模型后，檢測腫瘤小鼠模型內外周血中腫瘤細胞Gpb的比例、骨髓中腫瘤細胞Gbm的比 例、以及脾臟中腫瘤細胞Gsp的比例，根據所述比例參數指標評價免疫缺陷小鼠模型的免疫 缺陷程度。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細胞為同種或異種。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，腫瘤細胞移植的不同數量級為L=IXlO4個， M:1X105 個，H:1X106 個。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述異種腫瘤細胞為人源的腫瘤細胞，其 中人血液腫瘤細胞優選為人慢性髓系白血病K562細胞系，人實體腫瘤細胞優選為人肺癌 A549細胞系；。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述同種腫瘤細胞為鼠源腫瘤細胞，血液 腫瘤細胞優選小鼠淋巴瘤細胞系RMA，實體腫瘤細胞優選小鼠黑色素瘤細胞系B16-F10。6. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，根據檢測得到的腫瘤小鼠模型內外周血中 腫瘤細胞Gpb的比例、骨髓中腫瘤細胞Gbm的比例、以及脾臟中腫瘤細胞Gsp的比例，評價免疫 缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法包括如下步驟，（1)采用公式得到移植每個數量級血 液腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作用指數!^^1，枉727 = 2-6丨為6^、6疆、6講之和，0丨為將血 Di ' 液腫瘤細胞移植入免疫缺陷小鼠模型內到腫瘤細胞開始對免疫缺陷小鼠模型作用間隔的 時間，分別得到每個數量級血液腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作用指數HTEI(H)，HTEI(M)， HTEI (L)，最后再求得平均HTEI; (2) 采用公式得到移植每個數量級實體腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠模型的作用指數 Wn STEI，V/L/=T Wn為將實體腫瘤移植入免疫缺陷小鼠模型內形成的實體腫瘤的重量，Dn 為將實體腫瘤移植入免疫缺陷內到腫瘤細胞開始對免疫缺陷小鼠模型作用的間隔時間，分 別得到每個數量級實體腫瘤細胞對免疫缺陷小鼠的作用指數STEI (H)，STEI(M) ,STEI(L)， 最后再求得平均STEI; (3) 根據步驟（1)和步驟(2)得到的平均HTEI、平均STEI，采用如下公式得到總腫瘤作用 指數TEI，€總腫瘤作用指數與免疫缺陷程度呈負相關。
【文檔編號】A01K67/02GK105994125SQ201610056933
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年1月26日
【發明人】李鵬, 葉未, 肖毅仁, 蔣治武, 林思妙, 姚瑤, 王素娜, 李柏衡
【申請人】中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院