一種蘋果砧木組培繁殖技術的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蘋果砧木組培繁殖技術，所述蘋果砧木組培繁殖技術，包括以下步驟：1)前處理，2)無菌組織建立，3)愈傷組織分化培養及擴大培養，4)增長培養，5)分化出根，6)移栽培養；本發明所提供的組培繁殖技術，具有繁殖系數高、生產周期短、程序簡單易于操作、成本低廉等優點，適于蘋果砧木的快速繁殖。
【專利說明】
一種蘋果砧木組培繁殖技術
技術領域
[0001]本發明涉及植物組織培養技術領域，具體是一種蘋果砧木組培繁殖技術。
【背景技術】
[0002]蘋果(Apple)，是最常見的水果之一。蘋果樹屬于薔薇科，落葉喬木，葉橢圓形，有鋸齒。其果實球形，味甜，口感爽脆，且富含豐富的營養，是世界四大水果之冠。蘋果通常為紅色，不過也有黃色和綠色。蘋果是一種低熱量食物，每100克只產生60千卡熱量。蘋果屬落葉喬木，高達15米，樹干灰褐色，老皮有不規則的縱裂或片狀剝落，小枝幼時密生絨毛，后變光滑，紫褐色。葉序為單葉互生，橢圓形到卵形，長4.9?10厘米，先端尖，緣有圓鈍鋸齒，幼時兩面有毛，后表面光滑，暗綠色。花白色帶紅暈，徑3?5厘米，花梗與花萼均具有灰白色絨毛，萼葉長尖，宿存，雄蕊20，花柱5，大多數品種自花不育，需種植授粉樹。果為略扁之球形，徑5厘米以上，兩端均凹陷，端部常有棱脊。花期4?6月；果期7?11月果熟。蘋果是落葉喬木，有較強的極性，通常生長旺盛，樹冠高大，樹高可達15米，栽培條件下一般高3?5米左右。樹干灰褐色，老皮有不規則的縱裂或片狀剝落，小枝光滑。果實為仁果，顏色及大小因品種而異。喜光，喜微酸性到中性土壤。最適于土層深厚、富含有機質、心土為通氣排水良好的沙質土壤。繁殖栽培用嫁接繁殖。砧木有喬化砧和矮化砧。常用喬化砧有:楸子、西府海棠、山荊子，矮化砧主要引進英國品種。采用寬行密植，行向南北。偏南部地區秋冬土壤封凍前栽植，偏北部地區春季解凍時栽植。蘋果自花結實力差，栽植時必須配置授粉樹。當前蘋果砧木的組培繁殖技術存在操作復雜，繁殖周期長，成本較高等缺陷；因此蘋果砧木組培繁殖技術的開發，是十分緊迫的任務。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種蘋果砧木組培繁殖技術，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0004]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
[0005]—種蘋果砧木組培繁殖技術，包括以下步驟:
[0006]I)前處理
[0007]挑選健康無蟲害1cm長左右的蘋果站木半木質化新枝，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2%濃度的二氧化氯溶液中浸泡1min，使用小蘇打水沖洗15-20min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h;
[0008]2)無菌組織建立
[0009]在無菌工作臺上，將步驟I)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復沖洗，并使用熱風機吹干莖段表面的水分;使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養基中，并使其保持直立，初代培養條件為:黑暗，25°C-28°C，培養8天-15天；
[0010]3)愈傷組織分化培養及擴大培養
[0011]將在初代培養基中培養后的材料放置愈傷組織培養基中進行誘導分化，直至莖段中的小斷口產生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養條件為:900LX-1 10Lx，26°C-28°C，光照時間12h-16h，黑暗時間12h-8h，培養8天-15天;愈傷組織培養結束后，將莖段放置擴大培養基中進行增殖培養，如此循環往復，直至得到所需數量的無根苗；
[0012]4)增長培養
[0013]將無根苗的基部切開產生小斷口，轉入到增長培養基中培養，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養基中繼續培養7天，增長培養條件為SOOLx，28 °C_30°C，光照時間4h-8h，黑暗時間20h-16h;
[0014]5)分化出根
[0015]增長后的無根苗達到14cm-18cm時，將它們轉入生根誘導培養基中，生根誘導培養條件為:開始的3天-5天，黑暗，24°C培養;I OOOLx光照，28 °C培養15天；
[0016]6)移栽培養
[0017]待苗生根3-5條，根長3-5cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8%濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質組成并滅菌的基質中，套上塑料膜，保持相對濕度72%-76%，溫度280C-340C，3200Lx光照，48h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。
[0018]作為本發明進一步的方案:所述初代培養基主要成份為l/2MS+l/2NB+2mg//L鉬酸鈉+2mg/L鹽酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8-6.3。
[0019]作為本發明進一步的方案:所述愈傷組織培養基主要成份為MS+3mg/L6-BA+lmg/L NAA+80mg/Li3-羥基丁酸+20mg/L殼聚糖+32g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。
[0020]作為本發明進一步的方案:所述擴大培養基培養基主要成份為MS+0.2mg/LNAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亞鐵+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L瓊脂，pH 5.8-
6.0ο
[0021]作為本發明進一步的方案:所述增長培養基主要成份為2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.1mg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。
[0022]作為本發明進一步的方案:所述生根誘導培養基主要成份為GS+0.7mg/LNAA+
1.4mg/L I BA+1.8mg/L硫辛酸+2.2mg/L維生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.0-6.5o
[0023]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0024]本發明所提供的組培繁殖技術，具有繁殖系數高、生產周期短、程序簡單易于操作、成本低廉等優點，適于蘋果砧木的快速繁殖。
【具體實施方式】
[0025]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0026]實施例1
[0027]—種蘋果砧木組培繁殖技術，包括以下步驟:
[0028]I)前處理
[0029]挑選健康無蟲害1cm長左右的蘋果站木半木質化新枝，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2%濃度的二氧化氯溶液中浸泡1min，使用小蘇打水沖洗15min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h;
[0030]2)無菌組織建立
[0031]在無菌工作臺上，將步驟I)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復沖洗，并使用熱風機吹干莖段表面的水分;使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養基中，并使其保持直立，初代培養條件為:黑暗，25°C，培養8天；
[0032]3)愈傷組織分化培養及擴大培養
[0033]將在初代培養基中培養后的材料放置愈傷組織培養基中進行誘導分化，直至莖段中的小斷口產生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養條件為:900Lx，260C，光照時間12h，黑暗時間12h，培養8天;愈傷組織培養結束后，將莖段放置擴大培養基中進行增殖培養，如此循環往復，直至得到所需數量的無根苗；
[0034]4)增長培養
[0035]將無根苗的基部切開產生小斷口，轉入到增長培養基中培養，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養基中繼續培養7天，增長培養條件為SOOLx，28°C，光照時間4h，黑暗時間20h;
[0036]5)分化出根
[0037]增長后的無根苗達到14cm時，將它們轉入生根誘導培養基中，生根誘導培養條件為:開始的3天，黑暗，24 °C培養;I OOOLx光照，28 °C培養15天；
[0038]6)移栽培養
[0039]待苗生根3條，根長3cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8%濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質組成并滅菌的基質中，套上塑料膜，保持相對濕度72%，溫度28°C，3200Lx光照，48h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。
[0040]其中:
[0041 ] 所述初代培養基主要成份為l/2MS+l/2NB+2mg/L鉬酸鈉+2mg/L鹽酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8。
[0042]所述愈傷組織培養基主要成份為MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+80mg/U3-輕基丁酸+20mg/L殼聚糖+32g/L鹿糖+6g/L瓊脂，pH 5.8。
[0043]所述擴大培養基培養基主要成份為MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亞鐵+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L瓊脂，pH 5.8。
[0044]所述增長培養基主要成份為2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.lmg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L瓊脂，pH 5.8。
[0045]所述生根誘導培養基主要成份為GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L IBA+1.8mg/L硫辛酸+
2.2mg/L維生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.0。
[0046]實施例2
[0047]—種蘋果砧木組培繁殖技術，包括以下步驟:
[0048]I)前處理
[0049]挑選健康無蟲害1cm長左右的蘋果站木半木質化新枝，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2%濃度的二氧化氯溶液中浸泡lOmin，使用小蘇打水沖洗18min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h;
[0050]2)無菌組織建立
[0051]在無菌工作臺上，將步驟I)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復沖洗，并使用熱風機吹干莖段表面的水分;使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養基中，并使其保持直立，初代培養條件為:黑暗，27°C，培養11天；
[0052]3)愈傷組織分化培養及擴大培養
[0053]將在初代培養基中培養后的材料放置愈傷組織培養基中進行誘導分化，直至莖段中的小斷口產生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養條件為:1050Lx，27°C，光照時間14h，黑暗時間1h，培養12天;愈傷組織培養結束后，將莖段放置擴大培養基中進行增殖培養，如此循環往復，直至得到所需數量的無根苗；
[0054]4)增長培養
[0055]將無根苗的基部切開產生小斷口，轉入到增長培養基中培養，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養基中繼續培養7天，增長培養條件為SOOLx，29°C，光照時間6h，黑暗時間18h;
[0056]5)分化出根
[0057]增長后的無根苗達到16cm時，將它們轉入生根誘導培養基中，生根誘導培養條件為:開始的5天，黑暗，24 °C培養;I OOOLx光照，28 °C培養15天；
[0058]6)移栽培養
[0059]待苗生根4條，根長4cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8%濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質組成并滅菌的基質中，套上塑料膜，保持相對濕度74%，溫度31°C，3200Lx光照，48h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。
[0060]其中:
[0061 ] 所述初代培養基主要成份為l/2MS+l/2NB+2mg/L鉬酸鈉+2mg/L鹽酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 6.0。
[0062]所述愈傷組織培養基主要成份為MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+80mg/U3-輕基丁酸+20mg/L殼聚糖+32g/L鹿糖+6g/L瓊脂，pH 6.0。
[0063]所述擴大培養基培養基主要成份為MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亞鐵+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L瓊脂，pH 5.9。
[0064]所述增長培養基主要成份為2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.lmg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L瓊脂，pH 5.9。
[0065]所述生根誘導培養基主要成份為GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L IBA+1.8mg/L硫辛酸+
2.2mg/L維生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.3。
[0066]實施例3
[0067]—種蘋果砧木組培繁殖技術，包括以下步驟:
[0068]I)前處理
[0069]挑選健康無蟲害1cm長左右的蘋果站木半木質化新枝，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2%濃度的二氧化氯溶液中浸泡1min，使用小蘇打水沖洗20min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h ；
[0070]2)無菌組織建立
[0071]在無菌工作臺上，將步驟I)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復沖洗，并使用熱風機吹干莖段表面的水分;使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養基中，并使其保持直立，初代培養條件為:黑暗，28°C，培養15天；
[0072]3)愈傷組織分化培養及擴大培養
[0073]將在初代培養基中培養后的材料放置愈傷組織培養基中進行誘導分化，直至莖段中的小斷口產生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養條件為:IlOOLx，280C，光照時間16h，黑暗時間8h，培養15天;愈傷組織培養結束后，將莖段放置擴大培養基中進行增殖培養，如此循環往復，直至得到所需數量的無根苗；
[0074]4)增長培養
[0075]將無根苗的基部切開產生小斷口，轉入到增長培養基中培養，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養基中繼續培養7天，增長培養條件為SOOLx，30°C，光照時間8h，黑暗時間16h;
[0076]5)分化出根
[0077]增長后的無根苗達到18cm時，將它們轉入生根誘導培養基中，生根誘導培養條件為:開始的5天，黑暗，24 °C培養;I OOOLx光照，28 °C培養15天；
[0078]6)移栽培養
[0079]待苗生根5條，根長5cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8%濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質組成并滅菌的基質中，套上塑料膜，保持相對濕度76%，溫度34°C，3200Lx光照，48h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。
[0080]其中:
[0081 ] 所述初代培養基主要成份為l/2MS+l/2NB+2mg/L鉬酸鈉+2mg/L鹽酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 6.3。
[0082]所述愈傷組織培養基主要成份為MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+8Omg/L0-羥基丁酸+20mg/L殼聚糖+32g/L鹿糖+6g/L瓊脂，pH 6.0。
[0083]所述擴大培養基培養基主要成份為MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亞鐵+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L瓊脂，pH 6.0。
[0084]所述增長培養基主要成份為2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.lmg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L瓊脂，pH 6.0。
[0085]所述生根誘導培養基主要成份為GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L IBA+1.8mg/L硫辛酸+2.2mg/L維生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.5。
[0086]綜上所述，本發明采用上述組培繁殖技術后，生根率達97%以上，移栽成活率達95%以上。
[0087]對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。
[0088]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
【主權項】
1.一種蘋果砧木組培繁殖技術，其特征在于，包括以下步驟: 1)前處理 挑選健康無蟲害1cm長左右的蘋果站木半木質化新枝，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段;隨后置于2%濃度的二氧化氯溶液中浸泡lOmin，使用小蘇打水沖洗15_20min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h; 2)無菌組織建立 在無菌工作臺上，將步驟I)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復沖洗，并使用熱風機吹干莖段表面的水分;使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養基中，并使其保持直立，初代培養條件為:黑暗，25°C-28°C，培養8天-15天； 3)愈傷組織分化培養及擴大培養 將在初代培養基中培養后的材料放置愈傷組織培養基中進行誘導分化，直至莖段中的小斷口產生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養條件為:900Lx-l 10Lx，26°C-28°C，光照時間12h-16h，黑暗時間12h-8h，培養8天-15天;愈傷組織培養結束后，將莖段放置擴大培養基中進行增殖培養，如此循環往復，直至得到所需數量的無根苗； 4)增長培養 將無根苗的基部切開產生小斷口，轉入到增長培養基中培養，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養基中繼續培養7天，增長培養條件為800Lx，28 °C-30 °C，光照時間4h-8h，黑暗時間20h-16h; 5)分化出根 增長后的無根苗達到14cm-18cm時，將它們轉入生根誘導培養基中，生根誘導培養條件為:開始的3天-5天，黑暗，24 °C培養;I OOOLx光照，28 °C培養15天； 6)移栽培養 待苗生根3-5條，根長3-5cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8%濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質組成并滅菌的基質中，套上塑料膜，保持相對濕度72%-76%,溫度280C-340C，3200Lx光照，48h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。2.根據權利要求1所述的蘋果砧木組培繁殖技術，其特征在于，所述初代培養基主要成份為l/2MS+l/2NB+2mg/L鉬酸鈉+2mg/L鹽酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8-6.3。3.根據權利要求1或2所述的蘋果砧木組培繁殖技術，其特征在于，所述愈傷組織培養基主要成份為MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+80mg/Li3-羥基丁酸+20mg/L殼聚糖+32g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。4.根據權利要求3所述的蘋果砧木組培繁殖技術，其特征在于，所述擴大培養基培養基主要成份為MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亞鐵+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。5.根據權利要求4所述的蘋果砧木組培繁殖技術，其特征在于，所述增長培養基主要成份為2/3MS+0.2mg/L NAA+lmg/L GA3+0.1mg/L KT+2g/L蛋白胨+3g//L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。6.根據權利要求4所述的蘋果砧木組培繁殖技術，其特征在于，所述生根誘導培養基主要成份為 GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L I BA+1.8mg/L 硫辛酸+2.2mg/L 維生素 H+500mg/L 活性炭+32g/L蔗糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.0-6.5。
【文檔編號】A01H4/00GK105993963SQ201610604544
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月26日
【發明人】周開全, 陳子敏, 李謙盛, 李方盛
【申請人】象山宏森源農產品開發有限公司