草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法
【專利摘要】本發明公開了草莓花藥脫毒組培苗的移栽馴化方法，包括以下步驟：1）花粉采集與清洗消毒，2）誘導分化成苗，3）幼苗快繁與生根，4）出苗與洗苗，5）移栽，6）馴化。本發明的有益效果為：本發明提供的方法，無須練苗，直接洗凈培養基即可進行移栽，在苗床上搭建塑料拱棚，封閉三天后有效控制拱膜中溫度、基質濕度、光照時間和強度，花粉脫毒組培苗的成活率可達100%，獲得無病毒株的概率大幅提高；同時，草莓花粉脫毒率能達100%，可以不用病毒檢測程序，縮短了從脫毒到規模生產種苗的周期，有效降低了生產成本與勞動成本，大幅度提高生產效益，提供了大批量的優質脫毒種苗，為草莓可持續產業化健康發展提供了技術支撐。
【專利說明】
草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及植物組培育苗技術領域，具體涉及草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法。【背景技術】
[0003]花粉植物的試管苗在培養基上主要是靠培養基中的糖分進行異養代謝，而且在試管中濕度和溫度都比較穩定，一旦移入土壤，生理生態環境發生巨大變化，往往由于試管苗不能很快適應這種變化而造成大批死亡，特別是移栽適值自然氣溫高低變化頻繁，按期移栽很難成活。目前普遍采用是瓶苗有兩個階段煉苗過程:一是組培瓶苗移到室外在自然光下放置2 d?3 d練苗;二是再開瓶蓋煉苗3 d?5 d，結果是由異養換到自養環境時間短，幼苗還沒有適宜，再開瓶蓋，污染率迅速上升可達到30%?60%，大大降低幼苗的抵抗力，移栽后成活率大幅度下降。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，包括以下步驟:1)草莓花粉的取材與清洗消毒:采用田間草莓花粉發育至4_?6_大小的單核靠邊期的花藥，花粉單核靠邊期的草莓花蕾形態是:花萼未開放，花蕾略長于花冠或花冠剛露白、花冠白色或者淡綠且不松動、花藥微黃而充實;將采取的新鮮花藥放在2 °C?4°C中儲藏24h后，用自來水將花藥表面沖洗干凈;沖洗過的花藥移入超凈工作臺上放入無菌燒杯中，先用75%酒精消毒30 s?40s，無菌水沖洗2遍?3遍，再用0.1%的升萊溶液消毒4 min?5 min，用滅菌過的玻璃棒順一個方向輕輕攪動，然后用無菌水沖洗4遍?5遍，每次1 min，迅速用濾紙吸干，得到無菌花藥；2)花藥愈傷組織的誘導及莖葉分化:在無菌條件下，用無菌針將已消毒的花蕾固定在已經過滅菌的大橡皮上；用已滅菌的解剖刀和解剖針剝開花蕾，取出花藥，將取出的花藥接種到裝有愈傷組織誘導培養基上，愈傷組織誘導培養基組成為:MS+ BA 1.5 mg/L?2.5mg/L+NAA 0.10 mg/L?0.25mg/L+3%蔗糖+6g/L?8g/L瓊脂，pH值為5.8;當愈傷組織的直徑2 mm?3 mm時，轉入分化培養基中，分化培養基組成為:MS+ BA 0.08 mg/L?0.12mg/L+IBA 0.8 mg/L?1.2mg/L中+3%蔗糖+6g/L ?8g/L瓊脂，pH值為5.8;當形成明顯的叢生芽時將芽切成小塊，接種于叢生增殖培養基上進行增殖，叢生增殖培養基組成為:MS+BA 1.2 mg/L?1.8mg/L+NAA 0.08 mg/L?0.12mg/+ 3%蔗糖+6g/L?8g/L瓊脂L，pH值為5 ? 8;3)脫毒組培苗快繁及生根培養:將步驟2)得到的脫毒苗放入增殖培養基中25d?35d長成叢生瓶苗;增殖培養基為加入 6_芐氨基腺嘌呤0.19mg/L?0.21mg/L的MS培養基;將高3cm、生長健壯的無根苗接種于MS培養基上，2周后，苗基部長出輻射狀的白色小根，每株生根5條?7條，3周后，根生長1 cm?1.5cm，用于移栽；4)移栽前基質準備:基質的組成為:按照重量比草炭:珍珠巖:蛭石=3:1:1;在移苗前Id，將混合好、已潤濕的基質裝入32、50穴的穴盤或直徑9cm?12cm的營養缽中，輕壓；用50%的可濕性多菌靈粉劑1000倍液澆透，第二天移苗時，基質含水量為70%?80 %，即適合移苗；5)出瓶洗苗分級:起苗前用75 %酒精棉將所用操作工具全部消毒，直接從培養室移出生根的組培瓶苗到洗滌室，用直徑1 cm工具把組培苗從瓶中揀出，置于25 °C?28 °C的清水中洗凈根部的培養基，不要傷到根系、嫩芽及葉片，然后按大小將幼苗分級，并分出無根苗；6)移栽:當天把洗凈分級的組培苗運到種苗苗圃網室然進行移栽，用準備好的工具在穴盤的基質上插洞，將幼苗根部輕輕放入洞中，輕輕掩上，稍壓實;移完后用噴霧器輕噴水，沖洗幼苗葉片上的基質，使得根系與基質接觸更緊密，以利于根系生長;對于無根苗，先沾適宜濃度: NAA 0.05mg/L?0.1mg/L或IBA 0? 8mg/L?1.0mg/L的生根粉或生根劑，再移植，或移植后用濃度為800倍液的生根粉進行灌根；7)馴化:移栽完當天須在苗床上搭建塑料小拱棚，密封3d后每天早上或傍晚掀膜30min，從側面揭膜面積的10%，開始馴化組培苗;隨后每天揭膜時間增加lOmin，揭膜面積增加10%;視環境中的溫度高低和育苗基質含水量適當增加光照通風透氣時間，l〇d?15 d后可揭去薄膜;移植后需進行遮光管理，移植后的前2d用遮陽網遮光60%?70%，之后的10d?14d逐漸見光， 直至不遮光;馴化的組培苗成活率達100%，30d后便可移至直徑為10cm的營養缽或育苗床進行培育。
[0006]進一步的，上述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，所述步驟3)脫毒組培苗快繁及生根培養之前，可以采用酶聯免疫吸附法，即ELISA法進行病毒檢測。
[0007]進一步的，上述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，所述步驟2)中，花藥愈傷組織的誘導及莖葉分化生長條件為:溫度23°C?25°C，光照強度2500 lx?30001x，光照14 h/d?16h/d，培養時間20 d?30d。
[0008]進一步的，上述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，所述步驟3)中，脫毒組培苗快繁及生根培養的生長條件為:溫度23°C?25°C，光照強度2000 lx?30001x，光照10 h/ d?12h/d，快繁及生根兩個階段培養時間50 d?60d。
[0009]進一步的，上述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，所述步驟6)中，移栽條件為:溫度15°C?25°C。[〇〇1〇]進一步的，上述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，所述步驟7)中，馴化條件為:溫度20°C?38°C，培養時間20 d?30d。
[0011]本發明的有益效果為:本發明提供的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，采用在移栽前無須對瓶苗的練苗過程，直接從組織培養室移出生根的草莓組培瓶苗到洗滌室， 直接打開瓶蓋取苗，用25°c?28°C的溫水洗凈根部的培養基，當天運到種苗苗圃網室然進行移栽，移栽當天在苗床上搭建塑料拱棚，封閉三天后有效控制拱膜中溫度、基質濕度、光照時間和強度，花粉脫毒組培苗的成活率可達100%，采用花粉培養技術較莖尖培養和熱處理脫毒獲得無病毒株的概率大幅提高；同時，花粉脫毒不用病毒檢測程序，縮短了從脫毒到規模生產種苗的周期，有效降低了生產成本與勞動成本，大幅度提高生產效益，提供了大批量的優質脫毒種苗，為草莓可持續產業化健康發展提供了技術支撐。【具體實施方式】
[0012]本發明所用制劑來源:多菌靈:廠家:安徽華星化工股份有限公司；農藥登記證號:PD85150-19;生產許可證號:XK13-003-00126;產品標準證號:HG3290-2000;批號:2014 年 01 月 20 日；生根劑(粉):NAA的廠家:上海藍季科技發展有限公司Chembase，批號:Lot N0.B0013K0321017; IBA的廠家:上海藍季科技發展有限公司Chembase登記號:CAS 133-32-4批號: 141212。[0〇13] 實施例1:草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，包括以下步驟:1)草莓花粉的取材與清洗消毒:采用田間草莓花粉發育至4_?6_大小的單核靠邊期的花藥，花粉單核靠邊期的草莓花蕾形態是:花萼未開放，花蕾略長于花冠或花冠剛露白、花冠白色或者淡綠且不松動、花藥微黃而充實;將采取的新鮮花藥放在2 °C?4°C中儲藏24h后，用自來水將花藥表面沖洗干凈;沖洗過的花藥移入超凈工作臺上放入無菌燒杯中，先用75%酒精消毒30 s?40s，無菌水沖洗2遍?3遍，再用0.1%的升萊溶液消毒4 min?5 min，用滅菌過的玻璃棒順一個方向輕輕攪動，然后用無菌水沖洗4遍?5遍，每次1 min，迅速用濾紙吸干，得到無菌花藥；2)花藥愈傷組織的誘導及莖葉分化:在無菌條件下，用無菌針將已消毒的花蕾固定在已經過滅菌的大橡皮上；用已滅菌的解剖刀和解剖針剝開花蕾，取出花藥，將取出的花藥接種到裝有愈傷組織誘導培養基上，愈傷組織誘導培養基組成為:MS+ BA 1.5 mg/L?2.5mg/L+NAA 0.10 mg/L?0.25mg/L+3%蔗糖+6g/L?8g/L瓊脂，pH值為5.8;當愈傷組織的直徑2mm?3mm時，轉入分化培養基MS+ BA 0.08 11^幾?0.1211^幾+11^0.8 11^幾?1.211^/1^+3%鹿糖+68幾?88幾瓊脂中411值為5.8; 當形成明顯的叢生芽時將芽切成小塊，接種于叢生增殖培養基上進行增殖，叢生增殖培養基組成為MS+BA 1.2 mg/L?1.8mg/L+NAA 0.08 mg/L?0.12mg/L+3%鹿糖+6g/L?8g/L瓊脂，pH值為5.8;花藥愈傷組織的誘導及莖葉分化生長條件為:溫度23°C?25°C，光照強度2500 lx? 30001x，光照 14 h/d?16h/d，培養時間20 d?30d;3)脫毒組培苗快繁及生根培養:此步驟之前，可采用酶聯免疫吸附法，即ELISA法進行病毒檢測，也可不檢測；將步驟2)得到的脫毒苗放入增殖培養基中25 d?35d長成叢生瓶苗;增殖培養基為加入6-芐氨基腺嘌呤0.19mg/L?0.21mg/L的MS培養基;將高3cm、生長健壯的無根苗接種于MS 培養基上，2周后，苗基部長出輻射狀的白色小根，每株生根5條?7條，3周后，根生長1 cm? 1.5cm，用于移栽；脫毒組培苗快繁及生根培養的生長條件為:溫度23 °C?25 °C，光照強度2000 lx? 30001x，光照10 h/d?12h/d，快繁及生根兩個階段培養時間50 d?60d;4)移栽前基質準備:基質配方:草炭;珍珠巖:蛭石=3:1:1;在移苗前1天，將混合好、已潤濕的基質裝入32、50穴的穴盤或直徑9cm?12cm的營養缽中，輕壓；用50%的可濕性多菌靈粉劑1000倍液澆透，第二天移苗時，基質含水量為70%? 80 %，即適合移苗；5)出瓶洗苗分級:起苗前用75 %酒精棉將所用操作工具全部消毒，直接從培養室移出生根的組培瓶苗到洗滌室，用直徑1 cm工具把組培苗從瓶中揀出，置于25 °C?28 °C的清水中洗凈根部的培養基，不要傷到根系、嫩芽及葉片，然后按大小將幼苗分級，并分出無根苗；6)移栽:當天把洗凈分級的組培苗運到種苗苗圃網室然進行移栽，用準備好的工具在穴盤的基質上插洞，將幼苗根部輕輕放入洞中，輕輕掩上，稍壓實;移完后用噴霧器輕噴水，沖洗幼苗葉片上的基質，使得根系與基質接觸更緊密，以利于根系生長;對于無根苗，先沾適宜濃度: NAA 0.05mg/L?0.1mg/L或IBA 0? 8mg/L?1.0mg/L的生根粉或生根劑，再移植，或移植后用濃度為800倍液的生根粉進行灌根;移栽條件為:溫度15°C?25°C ;7)馴化:移栽完當天須在苗床上搭建塑料小拱棚，密封3d后每天早上或傍晚掀膜30min，從側面揭膜面積的10%，開始馴化組培苗;隨后每天揭膜時間增加lOmin，揭膜面積增加10%;視環境中的溫度高低和育苗基質含水量適當增加光照通風透氣時間，l〇d?15 d后可揭去薄膜;移植后需進行遮光管理，移植后的前2d用遮陽網遮光60%?70%，之后的10d?14d逐漸見光， 直至不遮光;馴化的組培苗成活率達100%，30d后便可移至直徑為10cm的營養缽或育苗床進行培育；馴化條件為:溫度20°C?38°C，培養時間20 d?30d。[〇〇14]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，其特征在于，包括以下步驟:1)草莓花粉的取材與清洗消毒:采用田間草莓花粉發育至4_?6mm大小的單核靠邊期的花藥，花粉單核靠邊期的草莓 花蕾形態是:花萼未開放，花蕾略長于花冠或花冠剛露白、花冠白色或者淡綠且不松動、花 藥微黃而充實;將采取的新鮮花藥放在2 °C?4 °C中儲藏24h后，用自來水將花藥表面沖洗 干凈；沖洗過的花藥移入超凈工作臺上放入無菌燒杯中，先用75%酒精消毒30 s?40 s，無 菌水沖洗2遍?3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒4 min?5 min，用滅菌過的玻璃棒順一個方 向輕輕攪動，然后用無菌水沖洗4遍?5遍，每次1分鐘，迅速用濾紙吸干，得到無菌花藥；2)花藥愈傷組織的誘導及莖葉分化:在無菌條件下，用無菌針將已消毒的花蕾固定在已經滅菌過的大橡皮上；用已滅菌的 解剖刀和解剖針剝開花蕾，取出花藥，將取出的花藥接種到裝有愈傷組織誘導培養基上，愈 傷組織誘導培養基組成為:MS+ BA 1.5 mg/L?2.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L?0.25mg/L+3%蔗 糖+6 g/L?8 g/L瓊脂，pH值為5.8;當愈傷組織的直徑2 mm?3 mm時，轉入分化培養基中， 分化培養基組成為:MS+ BA 0.08 mg/L?0.12mg/L+IBA 0.8 mg/L?1.2 mg/L+3%蔗糖+6 g/L?8 g/L瓊脂，pH值為5.8，當形成明顯的叢生芽時將芽切成小塊，接種于叢生增殖培養 基上進行增殖，叢生增殖培養基組成為:MS+BA 1.2 mg/L?1.8 mg/L+NAA 0.08 mg/L? 0 ? 12 mg/L+3%蔗糖+6 g/L?8 g/L瓊脂，pH值為5 ? 8;3)脫毒組培苗快繁及生根培養:將步驟2)得到的脫毒苗放入增殖培養基中25d?35d長成叢生瓶苗;增殖培養基為加入 6_芐氨基腺嘌呤0.19 mg/L?0.21 mg/L的MS培養基;將高3cm、生長健壯的無根苗接種于MS 培養基上，2周后，苗基部長出輻射狀的白色小根，每株生根5條?7條，3周后，根生長1 cm? 1.5cm，用于移栽；4)移栽前基質準備:基質的組成為:按照重量比草炭:珍珠巖:蛭石=3:1:1;在移苗前1天，將混合好、已潤濕的基質裝入32、50穴的穴盤或直徑9?12cm的營養缽 中，輕壓；用50%的可濕性多菌靈粉劑1000倍液澆透，第二天移苗時，基質含水量為70%?80 %，即適合移苗；5)出瓶洗苗分級:起苗前用75 %酒精棉將所用操作工具全部消毒，直接從培養室移出生根的組培瓶苗到 洗滌室，用直徑1 cm工具把組培苗從瓶中揀出，置于25 °C?28 °C的清水中洗凈根部的培養 基，不要傷到根系、嫩芽及葉片，然后按大小將幼苗分級，并分出無根苗；6)移栽:當天把洗凈分級的組培苗運到種苗苗圃網室然進行移栽，用準備好的工具在穴盤的基 質上插洞，將幼苗根部輕輕放入洞中，輕輕掩上，稍壓實;移完后用噴霧器輕噴水，沖洗幼苗 葉片上的基質，使得根系與基質接觸更緊密，以利于根系生長;對于無根苗，先沾適宜濃度: NAA 0.05mg/L?0.1mg/L或IBA 0.8 mg/L?1.0 mg/L的生根粉或生根劑，再移植，或移植后 用濃度為800倍液的生根粉進行灌根；7)馴化:移栽完當天須在苗床上搭建塑料小拱棚，密封3d后每天早上或傍晚掀膜30min，從側面揭膜面積的10%，開始馴化組培苗;隨后每天揭膜時間增加lOmin，揭膜面積增加10%;視環境 中的溫度高低和育苗基質含水量適當增加光照通風透氣時間，l〇d?15 d后可揭去薄膜;移 植后需進行遮光管理，移植后的前2d用遮陽網遮光60%?70%，之后的10 d?14d逐漸見光， 直至不遮光;馴化的組培苗成活率達100%，30d后便可移至直徑為10cm的營養缽或育苗床進行培育。2.根據權利要求1所述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，其特征在于，所述步驟 3)脫毒組培苗快繁及生根培養之前，采用酶聯免疫吸附法，S卩ELISA法進行病毒檢測。3.根據權利要求1所述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，其特征在于，所述步驟2)中，花藥愈傷組織的誘導及莖葉分化生長條件為:溫度23°C?25°C，光照強度2500 lx? 30001x，光照 14 h/d?16h/d，培養時間20 d?30d。4.根據權利要求1所述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，其特征在于，所述步驟3)中，脫毒組培苗快繁及生根培養的生長條件為:溫度23 °C?25 °C，光照強度2000 lx? 30001x，光照10 h/d?12h/d，快繁及生根兩個階段培養時間50 d?60d。5.根據權利要求1所述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，其特征在于，所述步驟6)中，移栽條件為:溫度15°C?25°C。6.根據權利要求1所述的草莓花粉脫毒組培苗的移栽馴化方法，其特征在于，所述步驟7)中，馴化條件為:溫度20°C?38°C，培養時間20 d?30d。
【文檔編號】A01H4/00GK105993962SQ201610603534
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月28日
【發明人】陳英, 張愛萍, 于盛, 張西英
【申請人】新疆生產建設兵團第六師農業科學研究所