一種鴨兒芹的組織培養方法
【專利摘要】本發明提供一種鴨兒芹的組織培養方法。現有技術中的鴨兒芹的組織培養，存在側芽誘導率低、愈傷組織不能繼續分化產生不定芽的問題，無法進行鴨兒芹的大量繁殖。一種鴨兒芹的組織培養方法，包括以下步驟：(1)外植體消毒處理；(2)愈傷組織誘導；(3)分化培養；(4)生根培養；(5)煉苗和移栽。本發明的方法用于鴨兒芹組織培養，克服其種子休眠期長、發芽率低等缺點，具有繁殖速度快、繁殖系數大，繁殖后代整齊一致，移栽成活率高的優點。可達到規模化生產的要求，而且能有效保持母本的優良遺傳性狀，保證了種苗的品質和質量。
【專利說明】
一種鴨兒芹的組織培養方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種鴨兒芹的繁育方法，特別地涉及一種鴨兒芹的組織培養方法，屬 于農業栽培技術領域。
【背景技術】
[0002] 鴨兒序（Cryptotaenia japonica Hassk.f.japonica)屬傘形科，鴨兒序屬，為多 年生草本。通常生于海拔200-2400米的山地、山溝及林下較陰濕的地區。我國南北各省（區） 均有分布，朝鮮和日本也有。
[0003] 鴨兒芹可全草入藥，治虛弱，尿閉及腫毒等，民間有用全草搗爛外敷治蛇咬傷。種 子含油約22%，可用于制肥皂和油漆。鴨兒芹是日本重要的栽培蔬菜之一。主要食用柔嫩的 莖葉，有特殊的風味，主要用作湯料或做成"色拉"菜生食。因其易于生長，耐陰濕環境，也可 作地被植物，應用于園藝造景中的角落、林下等蔭蔽環境。因此，鴨兒芹無論對調劑市場蔬 菜品種，對有機蔬菜的生產和創匯型農業的開發，還是豐富園林造景中地被植物的栽培種 類，都具有十分重要的意義。
[0004] 目前關于鴨兒芹的研究極少，國內的研究領域主要涉及一些特性的簡單描述，以 及種子萌發和栽培技術的研究。鴨兒芹休眠期長、種子萌發慢、發芽率普遍較低，采用常規 的種子繁殖方法速度慢。國內僅有一篇文獻涉及到鴨兒芹種子休眠破除的方法，但從種子 處理到發芽仍需要較長的時間（35~50天），并未加快種子發芽速度。組織培養技術具有繁 殖速度快、繁殖系數大，繁殖后代整齊一致，能保持原有品種的優良性狀，不受季節的限制 等優點，目前國內對鴨兒芹的組織培養研究僅有一篇報道，并且存在側芽誘導率低、愈傷組 織不能繼續分化產生不定芽的問題，無法進行鴨兒芹的大量繁殖。
[0005] 授權公告號為CN 103988667B，授權公告日為2016年3月23日的中國授權發明專利 中，公開了一種鴨兒芹引種栽培方法，該發明能使鴨兒芹發芽快，發芽率高，用該發明的栽 培方法能實現鴨兒芹周年生產和高產。但是，這種鴨兒芹的引種栽培方法，所需的時間較 長，且種子的發芽率較低，并不適合大量繁殖。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足，而提供一種繁殖系數提高， 適合大量繁殖的的鴨兒芹的組織培養方法。
[0007] 本發明解決上述問題所采用的技術方案是:該一種鴨兒芹的組織培養方法，其特 征在于，包括以下步驟：
[0008] (1)外植體消毒處理：選取生長良好的鴨兒芹一年生嫩莖，依次用洗衣粉浸泡 lOmin，自來水沖洗3h，用75%乙醇滅菌20~40s，無菌水沖洗3~5次，再用質量濃度為1.5~ 3.5 %的NaCIO滅菌5~lOmin，無菌水沖洗3~5次后，用滅菌濾紙吸干表面水分，最后將消毒 處理后的鴨兒芹置于無菌干凈的培養皿中備用；
[0009] (2)愈傷組織誘導:將步驟（1)中消毒好的鴨兒芹嫩莖切成約lcm的小段，豎直插入 誘導培養基中，進行暗培養30天，溫度23~25°C ;
[0010] (3)分化培養:將步驟(2)中產生的愈傷組織接入分化培養基中培養6周，溫度23~ 25°C，光照 12h/d，光照度為2000~24001x;
[0011] (4)生根培養:將步驟(3)中產生的叢生芽切成單株，接入生根培養基中培養，溫度 23~25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，2周后，基部長出根系，長度達到2~5cm;
[0012] (5)煉苗和移栽:將步驟(4)中高度大于4cm，葉片在4~6片，根系長度2~5cm的鴨 兒芹組培苗進行煉苗，先將培養瓶的瓶蓋打開，室溫下煉苗3d后，取出試管苗，洗凈根部的 培養基，移栽到準備好的基質上，保持溫度不低于l〇°C，不高于30 °C，濕度85%~95%，適當 遮陰，常規管理。
[0013]本發明所述步驟⑵中的誘導培養基為MS培養基，所述培養基內加入0.5~1. Omg/ L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0014] 本發明所述步驟(3)中的分化培養基為MS培養基，所述培養基內加入1.5~2. Omg/ L的6-芐基腺嘌呤、0.1~0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0015] 本發明所述步驟（4)中的生根培養基為1/2MS培養基，所述培養基內加入0.5~ 1.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0016] 本發明的優點為:本發明的方法用于鴨兒芹組織培養，克服其種子休眠期長、發芽 率低等缺點，具有繁殖速度快，繁殖系數大，繁殖后代整齊一致，移栽成活率高的優點。可達 到規模化生產的要求，而且能有效保持母本的優良遺傳性狀，保證了種苗的品質和質量。 [00 17]具體優點為：
[0018] 1、通過在誘導培養基中加入0.5~1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，可改善愈傷組織 的誘導情況，愈傷組織較多；
[0019] 2、通過在分化培養基中加入1.5~2. Omg/L的6-芐基腺嘌呤和0.1~0.2mg/L的萘 乙酸，可產生較多的叢生芽，提高產率；
[0020] 3、生根培養基選用1/2MS培養基，且生根培養基內加入0.5~1.5mg/LB引噪丁酸，使 生根效果更好，且生根快，根長，較粗，密集。
【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0022] 圖1是實施例1中步驟(2)誘導出的愈傷組織圖片。
[0023]圖2是實施例1中步驟(3)分化出的不定芽圖片。
[0024]圖3是實施例1中步驟(4)得到的鴨兒芹試管苗圖片。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖并通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發 明的解釋而本發明并不局限于以下實施例。
[0026] 實施例1。
[0027]本實施例的一種鴨兒芹的組織培養方法包括以下步驟：
[0028] (1)外植體消毒處理：選取生長良好的鴨兒芹一年生嫩莖，依次用洗衣粉浸泡 lOmin，自來水沖洗3h，在超凈工作臺上用75%乙醇滅菌20~40s，無菌水沖洗3~5次，再用 質量濃度為1.5~3.5%的NaCIO滅菌5~lOmin，無菌水沖洗3~5次后，用滅菌濾紙吸干表面 水分，最后將消毒處理后的鴨兒芹置于無菌干凈的培養皿中備用，外植體消毒可以把材料 表面上的各種微生物殺滅，同時，上述的消毒處理，消毒能力強，不易殘留，對環境無害。
[0029] (2)愈傷組織誘導:將步驟（1)中消毒好的鴨兒芹嫩莖切成約lcm的小段，豎直插入 誘導培養基中，進行暗培養30天，溫度23~25°C，愈傷組織誘導是外植體的局部受到創傷刺 激后，在傷口表面新生的組織，如圖1所示，圖1為通過步驟(2)而誘導出的愈傷組織。
[0030] (3)分化培養:將步驟(2)中產生的愈傷組織接入分化培養基中培養6周，溫度23~ 25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，促進細胞發育成各自的組織，最終形成叢生芽， 如圖2所示，圖2為通過步驟(3)而得到的分化出的不定芽。
[0031] (4)生根培養:將步驟(3)中產生的叢生芽切成單株，接入生根培養基中培養，溫度 23~25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，2周后，基部長出根系，長度達到2~5cm，圖3 為步驟(4)得到的鴨兒芹試管苗。
[0032] (5)煉苗和移栽:將步驟(4)中高度大于4cm，葉片在4~6片，根系長度2~5cm的鴨 兒芹組培苗進行煉苗，先將培養瓶的瓶蓋打開，室溫下煉苗3d后，取出試管苗，洗凈根部的 培養基，移栽到準備好的基質上，保持溫度不低于l〇°C，不高于30 °C，濕度85%~95%，適當 遮陰，常規管理，此處所指的常規管理為現有技術，此處不再贅述。
[0033]本實施例中的步驟(2)中的誘導培養基為MS培養基，培養基內加入0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0034]本實施例中的步驟(3)中的分化培養基為MS培養基，所述培養基內加入1.5mg/L的 6-芐基腺嘌呤、0. lmg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0035]本實施例中的步驟(4)中的生根培養基為1/2MS培養基，所述生根培養基內加入 0.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0036] 實施例2。
[0037] 本實施例的一種鴨兒芹的組織培養方法包括以下步驟：
[0038] (1)外植體消毒處理：選取生長良好的鴨兒芹一年生嫩莖，依次用洗衣粉浸泡 lOmin，自來水沖洗3h，在超凈工作臺上用75%乙醇滅菌20~40s，無菌水沖洗3~5次，再用 質量濃度為1.5~3.5%的NaCIO滅菌5~lOmin，無菌水沖洗3~5次后，用滅菌濾紙吸干表面 水分，最后將消毒處理后的鴨兒芹置于無菌干凈的培養皿中備用，外植體消毒可以把材料 表面上的各種微生物殺滅，同時，上述的消毒處理，消毒能力強，不易殘留，對環境無害。
[0039] (2)愈傷組織誘導:將步驟（1)中消毒好的鴨兒芹嫩莖切成約lcm的小段，豎直插入 誘導培養基中，進行暗培養30天，溫度23~25°C，愈傷組織誘導是外植體的局部受到創傷刺 激后，在傷口表面新生的組織。
[0040] (3)分化培養:將步驟(2)中產生的愈傷組織接入分化培養基中培養6周，溫度23~ 25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，促進細胞發育成各自的組織，最終形成叢生芽；
[0041] (4)生根培養:將步驟(3)中產生的叢生芽切成單株，接入生根培養基中培養，溫度 23~25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，2周后，基部長出根系，長度達到2~5cm;
[0042] (5)煉苗和移栽:將步驟(4)中高度大于4cm，葉片在4~6片，根系長度2~5cm的鴨 兒芹組培苗進行煉苗，先將培養瓶的瓶蓋打開，室溫下煉苗3d后，取出試管苗，洗凈根部的 培養基，移栽到準備好的基質上，保持溫度不低于l〇°C，不高于30 °C，濕度85%~95%，適當 遮陰，常規管理，此處所指的常規管理為現有技術，此處不再贅述。
[0043]本實施例中的步驟(2)中的誘導培養基為MS培養基，培養基內加入1. Omg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0044]本實施例中的步驟(3)中的分化培養基為MS培養基，所述培養基內加入2. Omg/L的 6-芐基腺嘌呤、0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0045] 本實施例中的步驟(4)中的生根培養基為1/2MS培養基，所述生根培養基內加入 1.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0046] 實施例3。
[0047] 本實施例的一種鴨兒芹的組織培養方法包括以下步驟：
[0048] (1)外植體消毒處理：選取生長良好的鴨兒芹一年生嫩莖，依次用洗衣粉浸泡 lOmin，自來水沖洗3h，在超凈工作臺上用75%乙醇滅菌20~40s，無菌水沖洗3~5次，再用 質量濃度為1.5~3.5%的NaCIO滅菌5~lOmin，無菌水沖洗3~5次后，用滅菌濾紙吸干表面 水分，最后將消毒處理后的鴨兒芹置于無菌干凈的培養皿中備用，外植體消毒可以把材料 表面上的各種微生物殺滅，同時，上述的消毒處理，消毒能力強，不易殘留，對環境無害。
[0049] (2)愈傷組織誘導:將步驟（1)中消毒好的鴨兒芹嫩莖切成約lcm的小段，豎直插入 誘導培養基中，進行暗培養30天，溫度23~25°C，愈傷組織誘導是外植體的局部受到創傷刺 激后，在傷口表面新生的組織。
[0050] (3)分化培養:將步驟(2)中產生的愈傷組織接入分化培養基中培養6周，溫度23~ 25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，促進細胞發育成各自的組織，最終形成叢生芽；
[0051] (4)生根培養:將步驟(3)中產生的叢生芽切成單株，接入生根培養基中培養，溫度 23~25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，2周后，基部長出根系，長度達到2~5cm;
[0052] (5)煉苗和移栽:將步驟(4)中高度大于4cm，葉片在4~6片，根系長度2~5cm的鴨 兒芹組培苗進行煉苗，先將培養瓶的瓶蓋打開，室溫下煉苗3d后，取出試管苗，洗凈根部的 培養基，移栽到準備好的基質上，保持溫度不低于l〇°C，不高于30 °C，濕度85%~95%，適當 遮陰，常規管理，此處所指的常規管理為現有技術，此處不再贅述。
[0053]本實施例中的步驟(2)中的誘導培養基為MS培養基，培養基內加入0.8mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0054]本實施例中的步驟(3)中的分化培養基為MS培養基，所述培養基內加入1.7mg/L的 6-芐基腺嘌呤、0.15mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0055]本實施例中的步驟(4)中的生根培養基為1/2MS培養基，所述生根培養基內加入 1. Omg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，調節pH為5.8。
[0056] 比較實驗1:
[0057]本實施例中不同濃度2,4_二氯苯氧乙酸對鴨兒芹莖段愈傷組織誘導的情況見表 1。誘導培養基均為MS培養基，添加不同濃度的2,4_二氯苯氧乙酸。
[0058]表1
[0059]
[0060] 由表1可看出，2，4-二氯苯氧乙酸濃度在0.2、0.5、0.8和l.Omg/L時，出現愈傷組 織，而在0.5和0.8mg/L時，愈傷組織多，在不添加2，4-二氯苯氧乙酸或2，4-二氯苯氧乙酸過 多時，無愈傷組織。
[0061 ] 比較實驗2:
[0062]本實施例中不同濃度6-芐基腺嘌呤和萘乙酸對鴨兒芹不定芽分化的影響見表2。 分化培養基均為MS培養基，添加不同濃度的6-芐基腺嘌呤和萘乙酸。
[0063] 表 2
[0064]
[0065]
[0066]由上表可看出，6-芐基腺嘌呤濃度為1.5mg/L，萘乙酸濃度為0. lmg/L，產生少量叢 生芽，而在6-芐基腺嘌呤濃度為2mg/L，萘乙酸濃度為0.2mg/L時，產生大量叢生芽。
[0067] 比較實驗3:
[0068] 本實施例中不同的生根培養基配方對鴨兒芹不定芽生根的影響情況見表3。
[0069] 表3
[0070]
[0071] 由上表可看出，1/2MS培養基+0.5mg/L吲哚丁酸，1/2MS培養基+1.0mg/L吲哚丁酸， 1/2MS培養基+1.5mg/L吲哚丁酸時，生根效果均較為明顯。
[0072]本處的MS培養基和1/2MS培養基均為現有技術，此處不再贅述。
[0073]本說明書中所描述的以上內容僅僅是對本發明所作的舉例說明。本發明所屬技術 領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式 替代，只要不偏離本發明說明書的內容或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本 發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種鴨兒芹的組織培養方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 外植體消毒處理:選取生長良好的鴨兒芹一年生嫩莖，依次用洗衣粉浸泡lOmin，自 來水沖洗3h，用75%乙醇滅菌20~40s，無菌水沖洗3~5次，再用質量濃度為1.5~3.5%的 NaCIO滅菌5~lOmin，無菌水沖洗3~5次后，用滅菌濾紙吸干表面水分，最后將消毒處理后 的鴨兒芹置于無菌干凈的培養皿中備用； (2) 愈傷組織誘導:將步驟(1)中消毒好的鴨兒芹嫩莖切成約lcm的小段，豎直插入誘導 培養基中，進行暗培養30天，溫度23~25 °C ; (3) 分化培養：將步驟（2)中產生的愈傷組織接入分化培養基中培養6周，溫度23~25 。(：，光照12h/d，光照度為2000~24001X; (4) 生根培養:將步驟(3)中產生的叢生芽切成單株，接入生根培養基中培養，溫度23~ 25°C，光照12h/d，光照度為2000~24001x，2周后，基部長出根系，長度達到2~5cm; (5) 煉苗和移栽:將步驟(4)中高度大于4cm，葉片在4~6片，根系長度2~5cm的鴨兒芹 組培苗進行煉苗，先將培養瓶的瓶蓋打開，室溫下煉苗3d后，取出試管苗，洗凈根部的培養 基，移栽到準備好的基質上，保持溫度不低于l〇°C，不高于30°C，濕度85%~95%，適當遮 陰，常規管理。2. 如權利要求1所述的鴨兒芹的組織培養方法，其特征是:所述步驟(2)中的誘導培養 基為MS培養基，所述培養基內加入0.5~1. Omg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L 的瓊脂粉，調節pH為5.8。3. 如權利要求1所述的鴨兒芹的組織培養方法，其特征是:所述步驟(3)中的分化培養 基為MS培養基，所述培養基內加入1.5~2. Omg/L的6-芐基腺嘌呤、0.1~0.2mg/L的萘乙酸、 30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂粉，調節pH為5.8。4. 如權利要求1所述的鴨兒芹的組織培養方法，其特征是:所述步驟(4)中的生根培養 基為1/2MS培養基，所述培養基內加入0.5~1.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，調 節pH為5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK105993958SQ201610546709
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】許陶昀, 陳超, 何杭鳳, 陳丹萍, 張平
【申請人】嘉興職業技術學院