一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法
【專利摘要】本發明提供了一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法，主要步驟是將誘變后培養獲得的花生外植體在添加了乙草胺的培養基上，進行抗乙草胺體的定向篩選。4周后將存活的外植體轉移到恢復生長培養基上培養。經篩選獲得的再生植株，取其葉片置于乙草胺溶液中，進行抗乙草胺的鑒定。本發明利用離體培養定向篩選和鑒定抗乙草胺體，操作方便，不受季節限制，可節省大量的人力、物力、財力。
【專利說明】
一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法
技術領域
[0001]本發明涉及花生離體定向篩選和鑒定方法，具體地說，是涉及一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法。
【背景技術】
[0002]花生是我國重要的油料作物和經濟作物之一，花生是一種抗旱耐瘠、適應性強的作物，在世界各地種植極其廣泛。隨著科學技術的不斷發展，農業勞動力逐步向城市轉化，農業機械化逐步代替人工作業，除草劑代替了人工鋤草。乙草胺是一種廣泛應用的除草劑。在花生上的應用是在花生播種后出苗前噴施，出苗以后及生育期噴施乙草胺會殺傷花生苗。然而，在花生生育期，雜草會不斷發芽生長，尤其是雨水較多的季節和地區，雜草生長非常快且茂盛，嚴重影響花生的產量。因此，篩選抗乙草胺體非常重要。
[0003]通常抗性篩選和鑒定是在大田進行，而離體誘變獲得的突變體，必須經過植株再生，馴化移栽成活后才能進行篩選和鑒定，如此需花費大量的人力、物力、財力。
[0004]國內外尚未見離體定向篩選抗乙草胺體的報道。
[0005]此外，花生再生植株的馴化移栽也是重要的一步，無菌嫁接技術能解決花生再生苗生根難的困難，但一般嫁接的再生苗首先在馴化室培養，等成活后才能移栽田間。馴化室中馴化占用空間大，時間長，并且嫁接的再生苗生長緩慢、容易染菌，造成成活率降低。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法，可以解決花生轉基因植株或離體誘變抗乙草胺突變體必須經過再生植株、馴化移栽大田成活后才能篩選和鑒定，從而耗費大量人力、物力、財力等問題。
[0007]為達到解決上述問題的目的，本發明采用以下技術方案予以實現:
1、一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法，包括如下步驟:
(I)將發生突變或遺傳轉化形成體胚/不定芽的外植體轉移至體胚萌發/植株再生及篩選培養基上培養，進行抗乙草胺體的定向篩選;所述體胚萌發/植株再生及篩選培養基以MS培養基為基本培養基，并添加4mg/L乙草胺和4?6mg/L BAP。
[0008](2)在體胚萌發/植株再生及篩選培養基上培養4周后，將存活的外植體轉移到恢復生長培養基上培養，得到抗乙草胺苗;所述恢復生長培養基以MS培養基為基本培養基，并添加4?6mg/L BAP。
[0009](3)在恢復培養基上獲得的抗乙草胺苗葉片完全展開后，取下葉片，放于乙草胺溶液中，進行抗乙草胺的鑒定。
[0010](4)經鑒定抗乙草胺的小苗，生長至1.5?2.5cm時，以抗乙草胺苗為接穗，無菌萌發的花生實生苗為砧木，進行無菌嫁接。
[0011](5)無菌嫁接苗轉回到盛有沙子的培養瓶中，在培養室培養2?3天，使傷口愈合。
[0012](6)搭建臨時塑料弓棚，寬度1.8?2.7米，高度1.2?1.5米，澆足水，保持空氣濕度。
[0013](7)抗乙草胺的嫁接瓶苗直接移栽塑料弓棚的土壤中，移栽的株距為40?45cm，株距為16?20cm，嫁接口在土壤表面以上，移栽后隨即澆水，保證根系需水。
[0014](8)嫁接苗移栽最初的2個周每天上午九點至下午4點搭遮蔭網，防止太陽直曬。
[0015](9)移栽2周后，撤去遮蔭網，并通風。
[0016](10)移栽3周后，撤去塑料弓棚。
[0017]優選地，所述步驟(I)中發生突變的形成體胚/不定芽的外植體，可以是任何形式誘變，可以是輻照誘變花生種子后，取胚小葉進行培養，誘導形成體胚/不定芽;也可以利用花生種子胚小葉作為外植體，在添加誘變劑的體胚誘導培養基上培養，誘導形成體胚;只要發生了突變均可以進行定向篩選。
[0018]優選地，所述步驟(I)和(2)中培養基均添加30g/L蔗糖，8g/L瓊脂，pH5.8;培養溫度均為24?26°C、光照強度為2000?3000Lx、光照時間為12-14h/d。
[0019]優選地，所述步驟(3)中用濃度為12mg/L的乙草胺溶液浸泡再生植株葉片3天，進行抗乙草胺的鑒定。
[0020]優選地，所述步驟(4)中作為砧木的實生苗是在滅菌的沙子中催芽苗齡10?13天的幼苗;沙子的滅菌是將沙子放于培養瓶中，加水漫過沙子，然后在高壓滅菌鍋中120°C滅菌20分鐘;嫁接操作過程在超凈工作臺內進行，砧木嫁接口在下胚軸。
[0021]優選地，所述步驟(5)中培養溫度為24?26 °C、光照強度為2000?3000Lx、光照時間為12-14h/d。
[0022]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
1、本發明可以對利用任何方法獲得抗乙草胺突變或遺傳轉化形成體胚/不定芽的外植體在培養基中進行定向篩選抗乙草胺體，淘汰非抗體，可節省大量的人力、物力、財力。
[0023]2、本發明在培養基中離體篩選抗乙草胺體，可以不受季節限制，常年可以進行離體定向篩選，操作方便。
[0024]3、本發明采用組培苗鑒定，在恢復培養基上獲得的抗乙草胺苗葉片完全展開后，取下葉片，放于12mg/L乙草胺溶液中浸泡3天，進行抗乙草胺的鑒定。
[0025]4、將嫁接的再生苗直接栽植大田(移栽最初3個周搭建臨時塑料弓棚，加遮蔭網)，可明顯提高成活率。以往是先將再生苗移栽于營養基質中置于馴化室培養，在營養基質中，由于嫁接的再生苗較弱，抵抗力差，很易染菌，從而降低成活率。本發明將嫁接的再生苗直接移栽大田，可避免移栽于基質中容易染菌，成活率低的困難。因為土壤中的微生物處于平衡狀態，有益菌能抑制有害菌的繁衍。本發明成活率可達95%。
[0026]5、將嫁接的再生苗直接栽植大田(移栽最初3個周搭塑料弓棚，加遮蔭網)，可縮短培養時間。以往是先將再生苗在馴化室培養3周后，再移至大田。本發明將嫁接的再生苗直接移栽大田，可節省培養時間20天以上。
[0027]6、將嫁接的再生苗直接移栽大田，減少了 I次移栽，也即減少了移栽對小苗生長的影響。并且由于嫁接的再生苗直接栽植土壤，根系伸展空間大，促使地上部分生長健壯。
[0028]7、將嫁接的再生苗直接移栽大田，減少了操作程序，不需要經過馴化室馴化的過程，節省空間，節省人力物力財力。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但是這些實例并不限制本發明的范圍。此外相關領域的普通技術人員對本發明做的任何改動，只要不脫離本發明的實質，都將等價落在本發明權利要求書所限定的范圍內。
[0030]實施例1
本發明所述一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法具體包括如下步驟:
1、培養基的制備。
[0031 ] (I)制備體胚誘導培養基:選取MS培養基為基本培養基，在此MS培養基中添加2，4_D配制成體胚誘導培養基，2，4-D的濃度為5?15mg/L。本案例中體胚誘導培養基為MS+10mg/L 2，4-0+308/1蔗糖+88/1瓊脂，將所述體胚誘導培養基的?!1調至5.8。在培養室溫度為24?260C、光照強度為2000?3000Lx、每日光照為12?14h的條件下進行培養，誘導體胚形成。
[0032](2)制備誘變培養基:在體胚誘導培養基中添加3?4mg/L平陽霉素，形成誘變培養基。本案例中誘變培養基為MS+10mg/L 2，4-D+4mg//L平陽霉素+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，將所述誘變培養基的pH調至5.8。在培養室溫度為24?26°C、光照強度為2000?3000Lx、每日光照為12?14h的條件下進行培養，誘導基因或染色體發生突變。
[0033](3)制備體胚萌發及篩選培養基:選取MS培養基為基本培養基，在此MS培養基中添加乙草胺和6-芐氨基嘌呤(BAP)形成體胚萌發及抗乙草胺定向篩選培養基，乙草胺的添加量為1、2、3、4、5、6、7、81^/1，84?的添加量為3?611^/1。本實施例中體胚萌發及篩選培養基為MS+乙草胺+4mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，將所述體胚萌發及篩選培養基的pH調至
5.8。在培養室溫度為24?26 °C、光照強度為2000?3000Lx、每日光照為12?14h的條件下進行培養。抗乙草胺定向篩選和體胚萌發同時進行
(4)制備體胚萌發(恢復生長)培養基:選取MS培養基為基本培養基，在此MS培養基中添加BAP形成恢復生長培養基，BAP的添加量為4?8mg/L。本實施例中恢復生長培養基為MS+4mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g//L瓊脂，將所述恢復生長培養基的pH調至5.8。在培養室溫度為24?26°C、光照強度為2000?3000Lx、每日光照為12?14h的條件下進行培養。
[0034]2、抗乙草胺篩選濃度的確定。
[0035]選用推廣栽培的花生品種花育25號，取成熟種子的種胚，進行表面消毒后，取胚小葉置于添加2，4-D( 10mg/L)的體胚誘導培養基上培養4周，誘導體胚形成。
[0036]將形成體胚的外植體轉移到添加4mg/L BAP和不同濃度的乙草胺(1、2、3、4、5、6、
7、8mg/L)的體胚萌發及篩選培養基上培養4周，然后轉移到恢復培養基上進行培養。
[0037]試驗結果表明，在含有乙草胺3mg/L的培養基上培養過的外植體仍有體胚萌發再生植株;而在6mg/L以上，外植體全部褐化;在添加4?5mg/L情況下，外植體生長受抑制，但保持活性，因此，確定體胚萌發和篩選培養基中適宜的乙草胺篩選濃度為4?5mg/L。
[0038]3、乙草胺鑒定濃度的確定。
[0039]選用花生品種花育25號胚小葉為外植體，置于添加2，4-D(10mg/L)的體胚誘導培養基上培養4周，誘導體胚的形成。然后，將形成體胚的外植體轉移到添加4mg/L BAP的體胚萌發培養基上，體胚萌發長成小苗。取再生小苗的葉片，浸泡于含有不同濃度(4，6，8，10，12，14，16，18，20mg/L)的乙草胺溶液中處理3天，以不加乙草胺為對照，進行葉片褪綠的比較。試驗結果表明，與對照相比，在添加乙草胺濃度超過12mg/L以上，葉片明顯褪綠，因此，確定抗乙草胺適宜的鑒定濃度為12mg/L。。
[0040]4、抗乙草胺體的篩選與鑒定
選用花生品種花育25號胚小葉為外植體，置于添加10mg/L 2，4-D和4mg//L平陽霉素的體胚誘導及誘變培養基上培養4周后，將形成體胚的外植體轉移到添加4mg/L BAP和4mg/L乙草胺的體胚萌發和篩選培養基上進行培養。轉移4周后，大部分外植體褐化，僅有少部分存活。將存活的外植體轉移到添加4mg/L BAP的恢復培養基上進行培養，部分體胚萌發長成小苗。
[0041]取上述定向篩選再生小苗的展開葉片浸泡于12mg/L乙草胺的溶液中處理3天，以花育25正常再生小苗(未經過誘變及定向篩選)的葉片為對照。結果顯示，對照葉片褪綠嚴重，而大部分定向篩選再生小苗的葉片無明顯變化，也有少部分經篩選獲得的再生小苗葉片褪綠嚴重，這可能是由于生理反應表現出抗性，而非遺傳物質發生改變。
[0042]5、乙草胺抗性苗的嫁接。
[0043]上述經鑒定的抗性苗作為砧木，滅菌沙子中無菌萌發10-13天苗齡的實生苗作為砧木，本案例中利用12天苗齡的實生苗作為砧木，在超凈工作臺內進行無菌嫁接，砧木的嫁接口在下胚軸。嫁接苗轉回到盛有沙子的培養瓶中，在培養室培養2?3天，使嫁接傷口愈合，本案例培養3天。培養室溫度為24?26°C、光照強度為2000?3000Lx、每日光照為12?14h的條件下進行培養。
[0044]6、乙草胺抗性嫁接苗的移栽。
[0045](I)嫁接抗性苗栽植前，先把大田施足底肥，每畝復合肥(N: P: K比例約為1:1:1)40斤，或每畝豬糞2車，并耕翻整平，本案例施用豬糞2車。
[0046](2)搭建塑料弓棚，寬度1.8?2.7米，高度1.2?1.5米。
[0047](3)塑料弓棚內澆足水，以保證棚內空氣濕度。
[0048](4)培養瓶中培養3天的嫁接抗性苗，直接移栽塑料弓棚的土壤中，嫁接口在土壤表面以上，移栽的株距為40?45cm，株距為16?20cm。
[0049](5)移栽后隨即澆水，保證嫁接苗根系需水。
[0050]7、嫁接苗移栽最初的2個周上午九點至下午4點搭遮蔭網，防止太陽直曬，嫁接苗移栽于塑料弓棚后生長迅速，成活率達90 %以上。
[0051]8、移栽2周后，撤去遮蔭網，并通風。
[0052]9、移栽3周后，撤去塑料弓棚，嫁接的乙草胺抗性苗在自然環境下生長。取上部幼嫩葉片，浸泡于30mg/L乙草胺溶液中進行抗乙草胺鑒定，以花育25葉片為對照。結果顯示，乙草胺抗性苗大部分葉片無明顯變化，僅有極少數葉片斑點褪綠，而對照全部葉片褪綠嚴重。
[0053]說明經離體定向篩選和培養瓶中葉片抗乙草胺鑒定具有抗性的再生苗對乙草胺不敏感，具有乙草胺抗性;本發明能夠離體篩選和離體鑒定出抗乙草胺體。
【主權項】
1.一種花生離體定向篩選和鑒定抗乙草胺體的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將發生突變或遺傳轉化形成體胚/不定芽的外植體轉移至體胚萌發/植株再生及篩選培養基上培養，進行抗乙草胺體的定向篩選;所述體胚萌發/植株再生及篩選培養基以MS培養基為基本培養基，并添加4mg/L乙草胺和4?6mg/L BAP; (2)在體胚萌發/植株再生及篩選培養基上培養4周后，將存活的外植體轉移到恢復生長培養基上培養，得到抗乙草胺苗;所述恢復生長培養基以MS培養基為基本培養基，并添加4?6mg/L BAP； (3)在恢復培養基上獲得的抗乙草胺苗葉片完全展開后，取下葉片，放于乙草胺溶液中，進行抗乙草胺的鑒定； (4)經鑒定抗乙草胺的小苗，生長至1.5?2.5cm時，以抗乙草胺苗為接穗，無菌萌發的花生實生苗為砧木，進行無菌嫁接； (5)無菌嫁接苗轉回到盛有沙子的培養瓶中，在培養室培養2?3天，使傷口愈合； (6)搭建臨時塑料弓棚，寬度1.8?2.7米，高度1.2?1.5米，澆足水，保持空氣濕度； (7)抗乙草胺的嫁接瓶苗直接移栽塑料弓棚的土壤中，移栽的株距為40?45cm，株距為16?20cm，嫁接口在土壤表面以上，移栽后隨即澆水，保證根系需水； (8)嫁接苗移栽最初的2個周上午九點至下午4點搭遮蔭網，防止太陽直曬； (9)移栽2周后，撤去遮蔭網，并通風； (10)移栽3周后，撤去塑料弓棚。2.根據權利要求1所述的一種花生離體誘變定向篩選抗乙草胺體的方法，其特征在于:所述步驟(I)中發生突變的形成體胚/不定芽的外植體，可以是任何形式誘變，可以是輻照誘變花生種子后，取胚小葉進行培養，誘導形成體胚/不定芽；也可以利用花生種子胚小葉作為外植體，在添加誘變劑的體胚誘導培養基上培養，誘導形成體胚;只要發生了突變均可以進行定向篩選。3.根據權利要求1所述的花生離體誘變定向篩選抗乙草胺體的方法，其特征在于:所述步驟(I)和(2)中培養基均添加30g/L蔗糖，8g/L瓊脂，pH 5.8;培養溫度均為24?26°C、光照強度為2000?3000Lx、光照時間為12-14h/d。4.根據權利要求1所述的花生離體誘變定向篩選抗乙草胺體的方法，其特征在于:所述步驟(3)中用濃度為12mg/L的乙草胺溶液浸泡再生植株葉片3天，進行抗乙草胺的鑒定。5.根據權利要求1所述的花生離體誘變定向篩選抗乙草胺體的方法，其特征在于:所述步驟(4)中作為砧木的實生苗是在滅菌的沙子中催芽苗齡10?13天的幼苗，沙子的滅菌是將沙子放于培養瓶中，加水漫過沙子，然后在高壓滅菌鍋中120°C滅菌20分鐘。6.根據權利要求1所述的花生離體誘變定向篩選抗乙草胺體的方法，其特征在于:所述步驟(4)中嫁接操作過程在超凈工作臺內進行，砧木嫁接口在下胚軸。7.根據權利要求1所述的花生離體誘變定向篩選抗乙草胺體的方法，其特征在于:所述步驟(5)中培養溫度為24?26°C、光照強度為2000?3000Lx、光照時間為12-14h/d。
【文檔編號】A01H4/00GK105993936SQ201610312428
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月12日
【發明人】王晶珊, 隋炯明, 喬利仙, 姜德鋒, 紀瑞瑞, 王鵬, 譚業杰, 孫世孟, 陳立濤
【申請人】青島農業大學