一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法
【專利摘要】本發明涉及有機合成領域，公開了一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟：制備培養基、制備懸浮液、培養、連續培養增殖數代。本發明培養可在任何時間進行繁殖，不受季節、環境等外部因素影響，且成本較低，占用空間資源較少；為泥炭蘚原絲體的生長提供必要的生長元素和環境。同時，能夠快速繁殖泥炭蘚原絲體，解決了生長速度慢、受環境影響大的技術問題。本發明選出的pH值與泥炭蘚自然生境偏酸土壤吻合。本發明加入的蔗糖提供了碳源，極大提高了泥炭蘚原絲體產量。本發明選用6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）作為細胞分裂素，對泥炭蘚原絲體的作用大于其他生長素。本發明篩選出激素6-BA的最佳濃度為0.05-0.2μmol/L，大于或小于此濃度反而抑制生長。
【專利說明】
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法
技術領域
[0001]本發明涉及園藝栽培技術領域，尤其涉及一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法。
【背景技術】
[0002]泥炭富含有機質和腐殖酸，可直接作為栽培介質，也可用作改良土壤的肥料，近年來，園藝產業的高速發展帶動了泥炭產業的形成。然而，泥炭的市場需求量不斷增多，泥炭濕地被過度開采，面積也不斷縮小，我國已經從泥炭出口國逐漸轉變為進口國。泥炭濕地的破壞不僅對植被分布、生態多樣性造成嚴重威脅，還會導致自然碳匯功能降低、人類居住環境惡化等一系列后果。為實現泥炭資源的可持續利用，同時不影響農業和園藝產業的發展，找到泥炭的替代品是亟待解決的問題。
[0003]泥炭蘚(Sphagnum, sp.)又稱水笞，是泥炭蘚屬植物的統稱，也是泥炭形成的主要來源。德國等歐美園藝發達國家已經研究將泥炭蘚替代泥炭作為生長基質，并成功應用于杜鵑、歐石楠等植物的栽培。因此，泥炭蘚的開發與應用能夠促進園藝產業的發展。
【發明內容】
[0004]本發明針對現有中的缺點，公開了一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決。
[0006]一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.1-0.3g的硝酸銨、0.05-0.15g的氯化鈣、0.05-0.15g的磷酸二氫鉀、0.05-0.15g的硫酸鎂、0.02-0.035g的氯化鐵；將pH值調節到5_6，再添加5_10g的蔗糖和0.05-0.2 μ mo I的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入0.5-1.5ml懸浮液，放入搖床，轉速130-150r/min，光照為2800_35001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h;該培養條件解決了泥炭蘚原絲體生長速度慢、易受環境影響的技術問題。
[0007]D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入0.5-1.5ml懸浮液，放入搖床，轉速130_150r/min，光照為2800-35001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ;培養20天后，原瓶中培養基養分耗盡，將增殖的原絲體再次粉碎。該培養條件解決了泥炭蘚原絲體生長速度慢的技術問題，達到快速增殖的目的。
[0008]E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0009]本發明采用的培養基為Beneck培養基。培養基為泥炭蘚原絲體的生長提供必要的生長元素和環境，所以培養基的篩選在整個快速繁殖過程中占有重要地位。研究過程中，進行了基本培養基的篩選，試驗培養基分別為:Beneck、Knop、BCD、MS、l/2MS、水。通過不同培養基的培養試驗發現，低鹽度的Beneck和Knop培養基較適合泥炭蘚的生長；而同樣是笞蘚常用培養基的BCD培養基則不適合泥炭蘚生長；高鹽度的不同濃度MS更不利于泥炭蘚的生長，甚至隨著培養時間的延長，原絲體會逐漸變黃。
[0010]研究過程中，進行了 pH值的篩選，試驗pH梯度分別為4、5、6、7、8。研究結果顯示，泥炭蘚原絲體也在pH較低的培養基上增殖較快，pH5.0-6.0是其最適宜的生長酸堿度，隨著PH的升高，泥炭蘚原絲體生長量減少，甚至停止生長。這與泥炭蘚自然生境偏酸土壤吻入口 ο
[0011]加入的蔗糖提供了碳源，極大提高了泥炭蘚原絲體產量。研究過程中，進行了碳源及其濃度的篩選，試驗碳源分別為蔗糖和葡萄糖，濃度分別為5 g/L、10 g/L、20 g/L、40g/Lo研究結果顯示，碳源的添加極大提高了泥炭蘚原絲體產量:蔗糖和葡萄糖均對其有顯著效果，但對蔗糖的利用效率較高，低濃度的蔗糖(5-1Og/L )更有利于泥炭蘚的增殖，增殖效率比高濃度處理多2.7-4.3倍。
[0012]本發明選用6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)作為細胞分裂素，對泥炭蘚原絲體的作用大于其他生長素，比如6-BA對泥炭蘚原絲體的作用大于生長素吲哚丁酸(IBA)，IBA對原絲體增殖無顯著作用。本發明篩選出激素6-BA的最佳濃度為0.05-0.2 ymol/L，大于或小于此濃度反而抑制生長。研究過程中，進行了激素及其濃度的篩選，試驗激素分別為IBA和6-BA，濃度分別為0.1 μ mol/L, I μ mol/L, 10 μ mol/L0研究結果顯示，細胞分裂素6-BA對泥炭蘚原絲體的作用大于生長素IBA。IBA對泥炭蘚原絲體增殖作用較小，高濃度(10 μ mol/L)還會抑制其生長。低濃度(0.05-0.2 μ mol/L) 6-BA顯著提高泥炭蘚產量，隨著濃度升高促進作用減弱。
[0013]作為優選，步驟A中，每I升水中加入0.2g的硝酸銨、0.1g的氯化鈣、0.1g的磷酸二氫鉀、0.1g的硫酸鎂、0.028g的氯化鐵；將pH值調節到5-6，再添加1g的蔗糖和0.1ymol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基。本發明篩選出的最佳培養基的配方??每I升水中加入0.2g的硝酸銨、0.1g的氯化鈣、0.1g的磷酸二氫鉀、0.1g的硫酸鎂、0.028g的氯化鐵。培養基為泥炭蘚原絲體的生長提供必要的生長元素和環境，該配比的培養基能夠快速繁殖泥炭蘚原絲體。
[0014]作為優選，步驟A中，硫酸鎂為MgSO4.7H20o
[0015]作為優選，步驟A中，氯化鐵為FeCl3.6 H2O0
[0016]作為優選，步驟A中，將培養基裝入500ml三角瓶中，每瓶裝約200ml，高壓滅菌待用。
[0017]作為優選，步驟B中，泥炭蘚原絲體在超凈工作臺粉碎lmin，粉碎速率為18000r/min, 200目細胞篩過濾；將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液。
[0018]作為優選，步驟C中，每1ml培養基中加入Iml懸浮液。
[0019]作為優選，步驟C中，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 ho
[0020]作為優選，步驟D中，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 ho
[0021]作為優選，步驟D中，每1ml培養基中加入Iml懸浮液。
[0022]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
本發明培養可在任何時間進行繁殖，不受季節、環境等外部因素影響，且成本較低，占用空間資源較少；為泥炭蘚原絲體的生長提供必要的生長元素和環境。同時，能夠快速繁殖泥炭蘚原絲體，解決了生長速度慢、受環境影響大的技術問題。
[0023]本發明選出的最佳pH值為5-6，與泥炭蘚自然生境偏酸土壤吻合。本發明加入的蔗糖提供了碳源，極大提高了泥炭蘚原絲體產量。本發明選出的最佳碳源為蔗糖，利用效率最高，且泥炭蘚原絲體的產量達到最高。本發明選用6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)作為細胞分裂素，對泥炭蘚原絲體的作用大于其他生長素，比如6-BA對泥炭蘚原絲體的作用大于生長素吲哚丁酸(IBA)，IBA對原絲體增殖無顯著作用。本發明篩選出激素6-BA的最佳濃度為
0.05-0.2 μ mol/L，大于或小于此濃度反而抑制生長。
【具體實施方式】
[0024]實施例1
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.2g的硝酸銨、0.1g的氯化鈣、0.1g的磷酸二氫鉀、0.1g的硫酸鎂、0.028g的氯化鐵；將pH值調節到5，再添加1g的蔗糖和0.1 μ mol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入Iml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入Iml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/ 夜 10 h/ 14 h ；
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0025]實施例2
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.1g的硝酸銨、0.05g的氯化鈣、0.05g的磷酸二氫鉀、0.05g的硫酸鎂、0.02g的氯化鐵；將pH值調節到5，再添加5g的蔗糖和0.05 μ mol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.泥炭蘚原絲體在超凈工作臺粉碎lmin，粉碎速率為18000r/min，200目細胞篩過濾；將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入
0.5ml懸浮液，放入搖床，轉速130r/min，光照為28001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入0.5ml懸浮液，放入搖床，轉速130r/min，光照為28001ux，光周期為晝 / 夜 10 h/ 14 h ;
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0026]實施例3
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.3g的硝酸銨、0.15g的氯化鈣、0.15g的磷酸二氫鉀、0.15g的硫酸鎂、0.035g的氯化鐵；將pH值調節到6，再添加1g的蔗糖和0.2 μ mol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；將培養基裝入500ml三角瓶中，每瓶裝約200ml，高壓滅菌待用。
[0027]B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入
1.5ml懸浮液，放入搖床，轉速150r/min，光照為35001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入1.5ml懸浮液，放入搖床，轉速150r/min，光照為35001ux，光周期為晝 / 夜 10 h/ 14 h ;
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0028]實施例4
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.15g的硝酸銨、0.08g的氯化鈣、0.08g的磷酸二氫鉀、0.08g的MgSO4.7Η20、0.025g 的 FeCl3.6 H2O ;將 pH 值調節到 5.5，再添加 6g 的蔗糖和 0.08 μ mol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入
0.8ml懸浮液，放入搖床，轉速135r/min，光照為29001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入0.8ml懸浮液，放入搖床，轉速135r/min，光照為29001ux，光周期為晝 / 夜 10 h/ 14 h ;
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0029]實施例5
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.28g的硝酸銨、0.12g的氯化鈣、0.12g的磷酸二氫鉀、0.14g的硫酸鎂、0.032g的氯化鐵；將pH值調節到6，再添加9g的蔗糖和0.18 μ mol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入
1.2ml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為34001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入1.2ml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為34001ux，光周期為晝 / 夜 10 h/ 14 h ;
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0030]實施例6
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.2g的硝酸銨、0.1g的氯化鈣、0.1g的磷酸二氫鉀、0.1g的硫酸鎂、0.028g的氯化鐵；將pH值調節到5，再添加1g的蔗糖和0.1 μ mol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.泥炭蘚原絲體在超凈工作臺粉碎lmin，粉碎速率為18000r/min，200目細胞篩過濾；將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液； C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入Iml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入Iml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/ 夜 10 h/ 14 h ；
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0031]實施例7
一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，包括以下步驟，
A.每I升水中加入0.2g的硝酸銨、0.1g的氯化鈣、0.1g的磷酸二氫鉀、0.1g的MgSO4.7Η20、0.028g的FeCl3.6 H2O ;將pH值調節到5，再添加1g的蔗糖和0.1 μ mo I的
6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基；
B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液；
C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入Iml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ；
D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入Iml懸浮液，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/ 夜 10 h/ 14 h ；
E.重復步驟D，連續培養增殖數代。
[0032]總之，以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應屬本發明專利的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:包括以下步驟， A.每I升水中加入0.1-0.3g的硝酸銨、0.05-0.15g的氯化鈣、0.05-0.15g的磷酸二氫鉀、0.05-0.15g的硫酸鎂、0.02-0.035g的氯化鐵；將pH值調節到5_6，再添加5_10g的蔗糖和0.05-0.2 μ mo I的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基；高壓滅菌處理培養基； B.粉碎泥炭蘚原絲體，過濾，將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液； C.向步驟A制備的培養基中加入步驟B制備的懸浮液，其中每1ml培養基中加入0.5-1.5ml懸浮液，放入搖床，轉速130-150r/min，光照為2800_35001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h ； D.培養20天后，再次粉碎泥炭蘚原絲體，過濾后分裝至步驟A制備的培養基中，其中每1ml培養基中加入0.5-1.5ml懸浮液，放入搖床，轉速130_150r/min，光照為2800-35001ux，光周期為晝 / 夜 10 h/ 14 h ； E.重復步驟D，連續培養增殖數代。2.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟A中，每I升水中加入0.2g的硝酸銨、0.1g的氯化鈣、0.1g的磷酸二氫鉀、0.1g的硫酸鎂、0.028g的氯化鐵；將PH值調節到5-6，再添加1g的蔗糖和0.1ymol的6-芐氨基腺嘌呤，得到培養基。3.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟A中，硫酸鎂為 MgSO4.7H20o4.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟A中，氯化鐵為 FeCl3.6 H2O05.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟A中，將培養基裝入500ml三角瓶中，每瓶裝約200ml，高壓滅菌待用。6.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟B中，泥炭蘚原絲體在超凈工作臺粉碎lmin，粉碎速率為18000r/min，200目細胞篩過濾；將粉碎好的泥炭蘚原絲體移入無菌水中，制成懸浮液。7.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟C中，每1ml培養基中加入Iml懸浮液。8.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟C中，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h。9.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟D中，放入搖床，轉速140r/min，光照為30001ux，光周期為晝/夜10 h/ 14 h。10.根據權利要求1所述的泥炭蘚原絲體快速繁殖的方法，其特征在于:步驟D中，每1ml培養基中加入Iml懸浮液。
【文檔編號】A01G31/00GK105981636SQ201510070439
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發明人】尹麗娟, 王鋮, 沈烈英
【申請人】上海市園林科學研究所