蛋白酶體抑制劑mg-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應用
【專利摘要】本發明屬于害蟲抗藥性防治領域，具體涉及蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應用。本發明將蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑增效劑，用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑MG‐132配制成30μM，再噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預處理，預處理24小時后施菊酯類殺蟲劑。本發明通過個體和細胞水平分別證明MG‐132能顯著提高溴氰菊酯的防效。
【專利說明】
蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的増效劑的應用
技術領域
[0001]本發明屬于害蟲抗藥性防治領域，具體涉及蛋白酶體抑制劑MG-132及一種治理小 菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
【背景技術】
[0002] 昆蟲對殺蟲劑的抗藥性是在藥劑的長期選擇作用下，昆蟲產生的一種生態適應和 進化現象。這種復雜的選擇過程顯然與多種代謝和調節相關，需要多種蛋白質和酶的參與。 蛋白酶體降解途徑是細胞內降解蛋白質的一個重要途徑，對于細胞許多生命功能的正常運 行，例如細胞周期調控，基因表達，氧化應激反應等都是必不可少的。
[0003] 溴氰菊酯是人工合成擬除蟲菊酯殺蟲劑中殺蟲毒力最大的一個品種，性質穩定， 殺蟲譜廣，生物活性高，在世界范圍內被廣泛應用。小菜蛾對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性發展 速度快，抗性最為顯著。小菜蛾的抗藥性問題是十分嚴重的，抗性治理也有一定的難度，要 有效解決這一問題，除了加速殺蟲劑新品種的開發外，更為切實可行的措施是增強現有殺 蟲劑的殺蟲效果，延長其有效使用時間。
[0004] MG-132是一種強效的，可逆的，細胞通透性的蛋白酶體抑制劑（IC50 = IOOnM)，與 20S和26S蛋白酶體結合并使其失活。尚沒有將MG-132用于害蟲防治的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供提高溴氰菊酯控制小菜蛾的方法及其應用。
[0006] 本發明公開了蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應用。
[0007] 本發明中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲劑。
[0008] 所說的MG-132是蛋白酶體的特異性抑制劑。
[0009] 本發明進一步通過實驗研究蛋白酶體抑制劑MG-132處理不同時間和不同處理濃 度對對溴氰菊酯毒性的影響。
[0010] (1)蛋白酶體抑制劑MG-132處理不同時間對溴氰菊酯毒性的影響
[0011]①首先用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑將蛋白酶體抑制劑配制成最終濃度為ΟμΜ， 1ΟμΜ，20μΜ，30μΜ，40μΜ和50μΜ〇
[0012] ②將處于對數期的果蠅Kc細胞預先接種到96孔板中，常規培養24h。
[0013] ③將2μL濃度為30μM的MG-l32加入到每孔中，繼續培養不同的時間（2h，4h，6h，8h， l〇h)。取各個時間點的細胞組進行下一步毒性檢測實驗。
[0014]④向經蛋白酶體抑制劑處理過的細胞中加入2yL濃度為30ppm的溴氰菊酯藥物(配 制溴氰菊酯的溶劑為DMS0)。每個藥物濃度設有3個復孔。
[0015] ⑤藥物處理細胞24h后，用臺盼藍染色法檢測細胞存活率。
[0016] ⑥與對照組相比，計算細胞相對存活率。
[0017] ⑵蛋白酶體抑制劑MG-132不同處理濃度對溴氰菊酯毒性的影響
[0018] ①基于上步的實驗結果，用不同濃度的蛋白酶體抑制劑(最終濃度為0μΜ，10μΜ，20 μΜ，30μΜ，40μΜ和50μΜ)預處理對數期果蠅Kc細胞6h;
[0019] ②對經蛋白酶體抑制劑處理過的細胞進行30ppm濃度的藥物刺激24h，每個濃度設 有3個復孔；
[0020] ③臺盼藍染色法檢測細胞存活率。（具體操作方法同前）。
[0021] (3)在施藥之前用MG-132處理幼蟲24小時，可明顯提高防效。
[0022]經研究表明：（1)蛋白酶體抑制劑對細胞蛋白酶體活性呈可逆性抑制現象。（2)MG-132預處理，能顯著提高溴氰菊酯處理細胞的死亡率。（3) JG-132預處理，使溴氰菊酯抗性 品系小菜蛾的抗性水平顯著下降。
[0023]進一步地，本發明提供了蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑增效劑的具體 應用方法，是用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑MG -13 2配制成3 0 μΜ，再噴灑到田間 小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預處理，預處理24小時后施菊酯類殺蟲劑。
[0024]本發明通過個體和細胞水平分別證明MG-132能顯著提高溴氰菊酯的防效，因此本 發明在抗性的防治應用中具有重要的意義。
【附圖說明】
[0025]圖1特定濃度蛋白酶體抑制劑處理不同時間對細胞活性的影響(*代表ρ〈0.05)。 [0026]圖2不同濃度蛋白酶體抑制劑MG-132處理對細胞活性的影響 [0027] 對照:僅用溴氰菊酯藥物處理的對照組細胞；
[0028] MG-132:用30ppm溴氰菊酯和相應濃度蛋白酶體抑制劑處理的細胞；
[0029] *代表ρ〈〇·〇5。
【具體實施方式】
[0030] 實施例一
[0031] 1、小菜蛾抗性品系
[0032] 小菜蛾源自貴州省貴陽市花溪區中曹鄉的甘藍地，室內繁殖一代后測四齡幼蟲的 LD5Q值，與武漢市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四齡幼蟲LD5q值比較，發現小菜蛾田間種群 為敏感種群。將其作為敏感品系同步隔離培養。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系(抗性倍數>5000) 由點滴法處理小菜蛾四齡幼蟲敏感品系經多代繁育選育而成。
[0033] 2、MG_ 132對溴氰菊酯毒性的影響
[0034] (1)特定濃度MG-132處理不同時間所引起的細胞活性的變化
[0035] 首先用特定濃度（30μΜ)的蛋白酶體抑制劑MG-132預處理果蠅Kc細胞不同時間 (Oh，2h，4h，6h，8h，IOh)，分別對每組細胞進行DM藥物(30ppm)處理，CCK-8試劑盒進行細胞 毒性檢測，結果發現，蛋白酶體抑制劑對細胞蛋白酶體活性呈可逆性抑制現象，并且在預處 理6h時，抑制效果達到最佳(附圖1)。
[0036] (2)不同濃度MG-132處理相同時間所引起的細胞活性的變化
[0037] 在上步實驗結果的基礎上，用不同濃度的蛋白酶體抑制劑MG-132預處理果蠅細胞 6h，再用濃度為30ppm溴氰菊酯藥物脅迫細胞，毒性檢測結果發現:經MG-132預處理的果蠅 細胞的死亡率明顯高于未經MG-132處理的對照組(control)細胞，并且在高濃度的MG-132 誘導下，果蠅細胞出現大面積的凋亡(附圖2)。
[0038] 3、MG_ 132對小菜蛾溴氰菊酯抗性水平的影響
[0039] (I)MG-132 預處理
[0040] 挑選生長狀態良好的抗性品系小菜蛾(DR)幼蟲作為實驗材料，腹腔顯微注射蛋白 酶體抑制劑(MG-132)(購自Sigma-Aldrich公司）24h后進行活體水平毒性檢測（臨用前用二 甲基亞砜溶解配成30μΜ)，在相同的條件下，對照組小菜蛾幼蟲腹腔則同時注射等體積的二 甲基亞砜(DMSO)。采用點滴法分別對實驗組和對照組幼蟲進行毒力測定(蘭亦全和趙士熙， 2003)〇
[0041 ] (2)毒性檢測
[0042]小菜蛾幼蟲經MG-132預處理24h后，用毛細微量進樣器將IyL溴氰菊酯藥劑點在幼 蟲的前胸背板上，每個濃度的藥劑分別處理50只小菜蛾幼蟲，然后放入用紗布封口的培養 皿中，人工喂食蘿卜苗。飼喂48h后統計不同濃度藥劑處理組幼蟲的死亡數，以輕觸蟲體不能 協調活動視為判斷死亡標準。
[0043]注:毒力測定實驗設有3次生物學重復。
[0044] (3)經MG-132處理后抗性品系小菜蛾幼蟲對溴氰菊酯毒力的變化
[0045]抗性品系小菜蛾幼蟲經不同濃度的溴氰菊酯藥物處理48h后，人工記錄各藥物濃 度處理組幼蟲的死亡數，采用SPSS軟件進行毒力回歸分析得出參數估計和回歸方程檢驗 表、95%的置信區間。通過分析得出小菜蛾抗性品系的毒力回歸方程為Probit(P)=-1.943 +1.017義，當？ = 0.5時，查得1^：50值為16.9口口111，95%的置信區間為9.76~15.35。
[0046]為了進一步研究蛋白酶體活性的改變與溴氰菊酯應激反應之間的關系，蛋白酶體 抑制劑MG-132被用來處理抗性品系小菜蛾幼蟲，經MG-132預處理后，再分別對處理組和未 處理組的小菜蛾幼蟲進行溴氰菊酯毒力測定。三次獨立的生物學實驗的結果經分析得：當 蛋白酶體的活性被抑制劑MG-132抑制之后，小菜蛾抗性品系對農藥溴氰菊酯的LC50的值被 顯著下調。結果如表1所示。
[0047]表1.經MG-132處理后抗性品系小菜蛾幼蟲對溴氰菊酯毒力的變化
[0049] η:代表幼蟲總數;*代表p<0.05。
【主權項】
1. 蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應用。2. 根據權利要求1所說的應用，其特征在于:其中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲 劑。3. 根據權利要求1所說的應用，其特征在于:其中所說的MG-132是蛋白酶體的特異性抑 制劑。4. 根據權利要求1所說的應用，其特征在于：用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑 MG-132配制成30μΜ，再噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預處理，預處理24小時后 施菊酯類殺蟲劑。
【文檔編號】A01P7/00GK105961426SQ201610303480
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】程羅根, 程晨, 胡俊麗, 李風良
【申請人】南京師范大學