一種井岡霉素在制備幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的應用

一種井岡霉素在制備幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種井岡霉素在制備幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的應用，井岡霉素能夠導致昆蟲發生畸形甚至死亡，并導致褐飛虱幾丁質的相對含量顯著降低，有效濃度范圍為0.1～10μg/μl，本發明能夠應用于害蟲防治中新型殺蟲劑的開發。
【專利說明】
一種井岡霉素在制備幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的 應用 (一)
技術領域
[0001] 本發明涉及一種海藻糖酶抑制劑對昆蟲幾丁質代謝相關蛋白的調控作用，特別涉 及Va I i damy C i η對昆蟲幾丁質代謝相關蛋白的調控作用及其效果評價。 (二)
【背景技術】
[0002] 我國是世界上農作物有害生物發生最為嚴重的國家之一。農作物生物災害發生頻 繁、為害嚴重、損失巨大。害蟲一直嚴重威脅全球農作物的安全生產(植物保護工程建設規 劃（2006-2010年），據報道全球約有植物重要害蟲6000多種，其中，在我國有發生的比例達 到30%，為1800多種。據估計，全球每年僅害蟲危害造成的產量損失已達總產量的18%，經 濟損失達1000億美元，其中僅每年用于植食性害蟲防治的費用就達75.6億美元。且目前至 少有30種農作物害蟲對40種殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性，采用傳統的單一農藥控制害 蟲的為害將會越來越困難。由此，害蟲防治的指導思想也已從"殺死害蟲"轉變為"調控害 蟲"。通過調控害蟲的生長發育將成為害蟲控制的重要手段，關鍵在于要找到能夠起調控作 用的靶標基因和開發出合適的生物農藥。
[0003] 海藻糖作為一種應激代謝產物，其含量可隨環境條件的變化而變化，其在各種逆 境條件下能夠起到保護作用，并且還能作為信號分子調控了糖酵解過程。海藻糖不但是昆 蟲血淋巴中的重要糖類物質，也是昆蟲的"血糖"，廣泛存在于幼蟲、蛹和成蟲階段。海藻糖 不僅可以作為能量物質為昆蟲的生長發育和生命活動提供所需能量，而且在冷凍和干旱等 逆境下可以大量合成，保護機體免受環境脅迫，從而提高昆蟲的生命力和活動能力。
[0004] 海藻糖酶作為昆蟲能量代謝必不可少的一類酶，也是昆蟲體內合成幾丁質途徑的 第一個酶。研究發現海藻糖酶的表達被抑制后，通過調控昆蟲的內部代謝能夠殺死害蟲。由 于海藻糖酶及其基因的重要性，其已經成為害蟲控制的重要靶標之一，具有實際農藥意義 的有效新型海藻糖酶抑制劑產品正在開發。各類海藻糖酶抑制劑相繼出現，效果較好的有 井岡霉素(Validamycin)、井岡霉亞基胺A、Trehazolin等，抑制作用主要是通過與海藻糖酶 活性位點上的氨基酸相互結合形成復合物，競爭性地抑制海藻糖酶的活性來實現的。這些 以海藻糖酶作為害蟲控制靶標的潛在殺蟲劑的殺蟲機理以及殺蟲效果的研究對開發出新 型殺蟲劑具有十分重要的意義。 (三)

【發明內容】

[0005] 本發明目的是提供一種Validamycin對昆蟲幾丁質代謝相關蛋白的調控作用， \%11(^1117〇;[11使昆蟲幾丁質合成酶以及幾丁質酶在1]11?嫩水平的表達下降，導致昆蟲發生畸 形甚至死亡，并導致昆蟲幾丁質相對含量顯著降低。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種井閃霉素在制備幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的應用。
[0008] 進一步，所述幾丁質代謝相關蛋白為幾丁質合成酶或幾丁質酶。
[0009] 進一步，所述幾丁質合成酶為下列基因之一編碼蛋白：CHSUCHSla或CHSlb。
[0010] 進一步，所述幾丁質酶為下列基因之一編碼蛋白：Chtl、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、 Cht7或Cht9〇
[0011] 進一步，所述抑制劑中井閃霉素有效濃度為O.l-lOyg/yl。
[0012] 進一步，所述有效濃度優選為5-10ygAU。
[0013]進一步，所述幾丁質代謝相關蛋白來自水稻褐飛虱(Nilaparvata lugens)。
[0014]所述的Val idamycin對昆蟲幾丁質代謝相關蛋白的調控作用的效果評價，所述的 效果評價為:利用超微量顯微注射的方法將濃度為〇. 1、〇. 5、1、5、IOygAU的Val idamycin分 別注射到昆蟲體內，于注射后48h觀察其在變態發育過程中的形態變化，然后統計其死亡率 和畸形率并測定昆蟲幾丁質的相對含量，進一步，所述的Validamycin對昆蟲幾丁質代謝相 關蛋白的調控作用的效果評價為:將濃度為0.1、〇. 5、1、5、10yg/yl的Val idamycin注射到褐 飛虱體內，于注射后48h觀察其在變態發育過程中的形態變化，然后統計其死亡率和畸形率 并測定昆蟲體內幾丁質的相對含量，結果顯示0.1、〇 . 5、1、5、lOyg/yl的Validamycin注射 48h后褐飛虱出現三種主要的畸形形態，分別為蛻皮困難、翅型異常以及蛻皮困難且翅型異 常。三種畸形的所占的比例不同，其中蛻皮困難和蛻皮困難且翅型異常所占的畸形百分比 較高。0.1、0.5、1、5、IOygAU的Validamycin注射48h后褐飛虱體內幾丁質含量均顯著下降。 [0015]本發明設置VaI idamyciη的高、中、低三個濃度，采用超微量顯微注射的方法對褐 飛虱進行顯微注射，于注射后48h統計褐飛虱的死亡率(結果見表1)，根據高、中、低濃度的 Val idamycin注射48h后褐飛虱的死亡率，獲得Val idamycin的有效濃度范圍為0.1~lOyg/y 1，然后設置〇. 1、〇.5、1、5、1(^8/^1這5個濃度的\%1丨(^1115^;[11對褐飛虱進行顯微注射，于注 射后48h測定昆蟲體內海藻糖酶活和幾丁質合成酶、幾丁質酶及幾丁質酶復合體基因的相 對表達量。具體方法如下：
[0016] 本發明設置高、中、低三個濃度的Validamycin，分別為15、2.5和0. lyg/μL，采用顯 微注射的方法將其注射到5齡第一天的活體褐飛虱若蟲體內，于注射后48h統計褐飛虱的死 亡率。高、中、低三個濃度的Validamycin注射后48h褐飛虱的死亡率分別為70%、30%和 10%，根據這一結果，獲得Validamycin的有效濃度范圍為0 · 1~IOygAU，并確定0 · 1、0· 5、 1、5、lOyg/yl 這5個有效的Validamycin 濃度。
[0017] 利用超微量顯微注射的方法將濃度為〇 · 1、〇· 5、1、5、IOygAU的Validamycin分別 注射到昆蟲體內，于注射后48h測定昆蟲體內海藻糖酶活性，并測定幾丁質合成酶基因和幾 丁質酶及幾丁質酶復合體的相對表達量。
[0018] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了井閃霉素在制備 幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的應用，Val idamycin能夠導致昆蟲發生畸形甚至死亡， 并導致褐飛虱幾丁質的相對含量顯著降低，有效濃度范圍為0.1~ioyg/μL，本發明能夠應 用于害蟲防治中新型殺蟲劑的開發。 (四）【附圖說明】
[0019] 圖1褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后的海藻糖酶酶活性變化:海藻糖酶 包括可溶性海藻糖酶和膜結合海藻糖酶;*表示P〈〇. 05，差異顯著，**表示P〈0.01，差異極顯 著，下同；
[0020] 圖2褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h幾丁質合成酶的相對表達情況:CHSl 及其兩個可變剪接體CHSla和CHSlb的相對表達量；
[0021] 圖3褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h幾丁質酶及幾丁質酶復合體的相對 表達情況：1〇個幾丁質酶及成蟲盤生長因子（Imaginal Disc Growth Factor,IDGF)基因和 β-Ν_乙酰葡糖胺內切酶(endoU-acetylglucosaminidase ,ENGase)基因的相對表達量 (A-L);
[0022]圖4褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后的表型:A表示注射48h后褐飛虱的 畸形形態，B表不注射48h后褐飛虱三種畸形百分比，C表不注射48h后褐飛虱的死亡率和畸 形率；
[0023]圖5褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后幾丁質的相對含量。 (五)【具體實施方式】
[0024] 下面具體實施例對本發明進行進一步說明，但本發明的保護范圍并不僅限于此：
[0025] 褐飛虱是水稻上的重要害蟲，全世界各地都有分布，該蟲具有繁殖速度快、生命周 期短、內稟增長率高、環境適應性強等特點，在外界環境適宜時極易暴發成災，給水稻生產 造成巨大的損失。在下述實施例中以褐飛虱為例對本發明進行了詳細說明。
[0026] 井閃霉素 （Validamycin ,technical)購自德國Dr .Ehrenstorfer公司。
[0027] 實施例1 =Validamycin有效濃度的篩選
[0028] 1.實驗材料:褐飛虱(Nilaparvata Iugens)來自本實驗室飼養種群，供試蟲源來 自浙江農科院杭州種群。褐飛虱的飼養條件為：溫度25土 TC，光照比16L:8D，相對濕度為 70%。褐飛虱飼養水稻品種為TNl。
[0029] 2.褐飛虱Validamycin的顯微注射：用無菌水配制高、中、低三個不同濃度的井岡 霉素注射液，分別為15μ〖/μ1、2.5μ〖/μ1、0.1μ〖/μ1。注射前首先用標準毛細管定量每次注射 器栗出的井閃霉素注射液的體積，并通過調整氮氣壓來調整井閃霉素注射液的體積使其符 合注射量。將5齡第一天活體褐飛虱用CO 2氣體麻醉后放至注射盤上，使其腹部朝上，注射腹 面口器末端，注射量為IOOnl/頭，注射后將其放至裝有新鮮水稻苗的試管中，于注射后48h 觀察死亡率，結果見表1所示。
[0030] 表1高、中、低三個濃度梯度Validamycin注射后的死亡率
[0032] 注:數據為平均數土標準差，對照組為無菌水注射組。
[0033] 表1的結果表明注射15、2.5、0.1以8/^1三個濃度梯度的￥&1丨(1 &11^(^114811后褐飛虱 的死亡率依次為70%、30%和10%，為了便于后續實驗海藻糖酶活的測定，預期褐飛虱的死 亡率為1〇%_50%，確定0· 1、0·5、1、5、lOyg/yl這5個Validamycin的注射濃度。
[0034] 實施例2:褐飛虱注射有效濃度的Validamycin48h后海藻糖酶活性的變化
[0035] 1.根據實施例1得到的Validamycin有效濃度的篩選結果，設置Validamycin的5個 有效濃度梯度（用無菌水配制），分別為O. I、〇. 5、I、5、10yg/yl，對5齡第一天的活體褐飛虱 若蟲進行超微量顯微注射，方法同實施例1，于注射后48h取材進行后續定量實驗。
[0036] 2.褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后海藻糖酶活性的測定：取30頭褐飛 虱，加入1ml PBS冰浴超聲破碎30min; 4°C，1000 g，離心20min;取350μ1上清4°C，20800g，超 離心lh;吸出超離心后的上清用于可溶性海藻糖酶活性和蛋白濃度的測定;沉淀用PBS洗兩 次并用PBS懸浮，該懸浮液用于膜結合型海藻糖酶活性和蛋白濃度的測定。利用葡萄糖分析 試劑盒(Sigma)進行海藻糖酶濃度的測定，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)進行蛋白 濃度的測定，酶活性單位為mmol glucose/yg protein/minute，結果如圖1所示。
[0037] 圖1的結果表明，注射0.1、0.5、I、5、IOygAU這5個濃度的Validamycin48h后褐飛 虱體內可溶性海藻糖酶和膜結合型海藻糖酶的活性均顯著低于對照組(等量無菌水），表明 0.1、0.5、1、5、IOygAil這5個Validamycin注射濃度能有效抑制褐飛虱海藻糖酶活性。
[0038] 實施例3:褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后幾丁質合成酶、幾丁質酶及 其復合體基因的相對表達情況
[0039] 1.褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后幾丁質合成酶基因的相對表達情況
[0040] 對實施例2方法注射0.1、0.5、1、5、1(^/^1的￥&11(1&11^(^114811后的褐飛虱分別進 行液氮研磨，抽提RNA，取總量Iyg的RNA進行cDNA單鏈合成，取反轉錄產物ΙμL用于qRT-PCR 的模板。qRT-PCR反應體系為20μ1，具體如下：正、反向引物各ΙμL，cDNA ΙμL，SYBR Premix ExTaq(Takara)IOyl，滅菌超純水補至20μ1，引物序列如下：
[0041 ] CHSlF:5 '-CCGCAAACGATTCCTACAGA-3 '
[0042] CHSIR:5 '-AGGTCCTTGACGCTCATTCC-3 '
[0043] CHSIaF:5 '-TGTTCTTGCTACAACTCAATAAA-3 '
[0044] CHSlaR:5 '-ACACCAATCCGATAGGCTC-3 '
[0045] CHSIbF:5 '-GCTGTCTTTGCTTTCTTCAT-3 '
[0046] CHSlbR:5 '-ACACCAATCCGATAGGCTC-3 '
[0047] 18SF:5 '-CGCTACTACCGATTGAA-3 '
[0048] 18SR:5 '-GGAAACCTTGTTACGACTT-3 '
[0049] 褐飛虱幾丁質合成酶基因 CHSl (包括CHSla和CHSlb)以及18S序列為公知序列。具 體的PCR程序為:94°C預變性5min，94°C變性15s，60°C退火30s，60°C延伸30s，40個循環。采 用2^ ΛΛΤ方法和STATISTICA6.0中的ANOVA進行數據分析，結果見圖2所示。
[0050] 2.褐飛虱注射有效濃度的Validamycin48h后幾丁質酶及其復合體基因的相對表 達情況
[0051 ] 對實施例2方法注射0.1、0.5、1、5、1(^8/^1的￥&1丨(1 &11^(^114811后的褐飛虱進行幾 丁質酶及其復合體的qRT-PCR檢測，方法同上，引物如下：
[0052] ChtlF:5 '-AGGTGGTTAGGGACGAGGAG-3，
[0053] ChtlR:5 '-TGCGCTTGACATAGTTGGACT-3 '
[0054] Cht2F:5 '-GCAGATTTCTGGACAGGGAA-3 '
[0055] Cht2R:5，-TGACGCACAAGCGGGAAG-3 '
[0056] Cht3F:5 '-CTACACCTCTGGCTAAACTCGG-3 '
[0057] Cht3R:5 '-AACTTGTCCTTGCGGCTGAT-3 '
[0058] Cht4F:5 '-TTGAGGAGGTTCACGGGTCT-3 '
[0059] Cht4R:5 '-CCTTACTGGAAACGAGGTTGG-3 '
[0060] Cht5F:5 '-AAAGCGTTCGTGATGAAATAGC-3 '
[0061 ] Cht5R:5 '-GATCCTTTGCCTCAATCCAAT-3 '
[0062] Cht6F:5 '-GCTGGTAAGGAGATGCTATTCG-3 '
[0063] Cht6R:5 '-GTGGTTCTAAGGCTGGCTGTC-3 '
[0064] Cht7F:5 '-CTACTCTGCCATCCCATTCCT-3 '
[0065] Cht7R:5 '-GTCTGGGTTTCTTCACTTCCTG-3 '
[0066] Cht8F:5 '-GAACAAAGTGCAAACTCAGTCC-3 '
[0067] Cht8R:5 '-CACCTTCTGTGGCTTCTGG-3 '
[0068] Cht9F:5 '-GTGCGGTATTGGTTGAAGAGG-3 '
[0069] Cht9R:5 '-GGTATAACGTGATTCCGAGCC-3 '
[0070] ChtlOF:5-CAAGCCAATACCCAACAAAC-3 '
[0071] ChtlOR:5 '-ACAGCAAATCCATAGAGCACA-3 '
[0072] IDGFF:5，-AAAAGAACGAGGAGGAGGG-3，
[0073] IDGFR:5 '-TTGCTTGAGGATGGGGTAC-3 '
[0074] ENGaseF:5 '-TGTGGCAAGACTTCGTTA-3 '
[0075] ENGaseR:5 '-ATGGGAGGGTTGGGATAG-3 '
[0076] 褐飛虱幾丁質酶及幾丁質酶復合體基因Chtl、Cht2、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7、 Cht8、Cht9、ChtlO、IDGF和ENGase的序列為公知序列。
[0077]結果如圖3所示。
[0078] 圖2和圖3的結果顯示，注射0 · I、0 · 5、1、5、IOygAU的Val idamycin48h后褐飛虱體 內CHSl及其兩個剪接體CHSla和CHSlb的相對表達量均顯著低于對照組(等量無菌水），且隨 著Validamycin注射濃度的升高CHSl (包括CHSla和CHSlb)基因的相對表達量越低。Chtl、 Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7和Cht9這7個基因的相對表達量均顯著低于對照組，表明 Validamycin能有效的抑制幾丁質合成酶及幾丁質酶基因的表達。
[0079] 實施例4: Validamycin對昆蟲幾丁質代謝相關蛋白的調控作用的效果評價
[0080] 1.褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后的變態發育情況
[0081 ] 對實施例2方法注射0.1、0.5、1、5、IOygAU的Validamycin 48h后褐飛虱進行表型 觀察，并統計其畸形率和死亡率，結果如圖4所示。
[0082] 2.褐飛虱注射有效濃度的Validamycin 48h后的幾丁質相對含量的測定
[0083] 首先將實施例2方法注射0.1、0·5、1、5、IOygAU的Validamycin 48h后的30頭褐飛 虱用清水沖洗干凈，置于濾紙上，50°C烘箱內烘干，約4d;然后將烘干的褐飛虱研磨成粉末， 在電子分析天平上稱重，記為Wl;之后將已知質量的褐飛虱粉末倒入消化管中（自制消化 管:取試管一根，配以橡皮塞，在橡皮塞上鉆5mm孔，插上玻璃管，橡皮塞外端的玻璃管上再 接一根橡皮管，長30-50cm，橡皮管的另一端再接一根玻璃管，并將開口的玻璃管通入水槽 內，以防止加熱時堿液濺出），向消化管中加入5ml飽和氫氧化鉀，160°C甘油浴15-20min;再 用濾紙過濾殘渣，然后用緩慢的流水沖洗干凈，將殘渣置于50°C烘箱中烘lh，在分析天平稱 重，計為W2;最后結果計算，幾丁質的相對含量=^χ1.26χ100 (%)(其中！.26-轉換 π 1 系數，轉換系數=乙酰氨基相對分子質量/氨基葡萄糖相對分子質量）。
[0084] 結果如圖5所示，0.1、0.5、l、5、10ygAU這5個濃度的Validamycin注射組的褐飛虱 幾丁質相對含量分別為16.3%、10.33%、9.50%、8.70%和8.20%，而對照組的褐飛虱幾丁 質相對含量為21.36%，0.1、0.5、1、5、IOygAU這5個濃度的Validamycin注射組的褐飛虱幾 丁質相對含量均顯著低于對照組。
[0085] 圖4和圖5的結果表明，Validamycin能夠導致褐飛虱畸形甚至死亡，畸形率和死亡 率隨著Validamycin濃度的增加而增加，在Validamycin注射濃度為0. lyg/yl時褐飛虱的畸 形率和死亡率最低，分別為13.33%和10%，在Validamycin注射濃度為IOygAU時褐飛虱的 畸形率和死亡率最高，分別為37.78%和56.67%。其次，在Validamycin注射濃度為5yg/yl 時褐飛虱的畸形率和死亡率分別為32.22%和37.63%，與Validamycin注射濃度為IOygAU 時的死亡率相差較大，但畸形率相差不大，表明Validamycin注射濃度為5ygAU和IOygAU 均能導致褐飛虱高畸形率，Validamycin對昆蟲幾丁質代謝相關蛋白的調控作用的有效濃 度優選為5_10yg/yl之間的濃度。褐飛虱注射0.1、0.5、1、5、10yg/yl的Validamycin48h后均 出現三種主要的畸形形態，分別為蛻皮困難、翅型異常以及蛻皮困難且翅型異常。三種畸形 形態的表現程度不同，蛻皮困難且翅型異常所占的比例較高，其次為蛻皮困難。此外，注射 0.1、0.5、1、5、1(^8/^1這5個有效濃度的\^11(1&11^(^11還能夠導致褐飛虱的幾丁質相對含量 降低，且隨著Validamycin注射濃度的升高，幾丁質的相對含量越低。
【主權項】
1. 一種井閃霉素在制備幾丁質代謝相關蛋白活性抑制劑中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述幾丁質代謝相關蛋白為幾丁質合成酶或 幾丁質酶。3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述幾丁質合成酶為下列基因之一編碼蛋白： CHSl、CHSla或CHSlb〇4. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述幾丁質酶為下列基因之一編碼蛋白： Cht 1、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7 或 Cht9。5. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述抑制劑中井閃霉素有效濃度為0.1-10yg/ μ1〇6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于所述有效濃度為5-10ygAU。7. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述幾丁質代謝相關蛋白來自水稻褐飛虱。
【文檔編號】A01N43/16GK105961393SQ201610312281
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月11日
【發明人】唐斌, 楊萌萌, 沈祺達, 王世貴
【申請人】杭州師范大學