一種唾液保存液及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發明公開了一種唾液保存液，包括如下組分和含量：Tris?HCl 5?80mmol/L，SDS 0.1?4%（w/v），EDTA 1?20mmol/L，氯化鈉50?200mmol/L，體系pH范圍在7?10之間。本發明的唾液保存液配方簡單，用于保存人體唾液樣本，能夠在室溫條件下長期保存唾液，所保存的唾液中DNA完整性好，能夠保證唾液樣本在各采集地之間運輸過程中的穩定性，適用于基因檢測及相關科學研究。
【專利說明】
_種唾液保存液及其制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學技術領域，特別是涉及一種唾液保存液及其制備方法和用 途。
【背景技術】
[0002] DNA樣本在分子生物學、醫學鑒定、檢測與治療等領域中應用廣泛，占有重要的地 位。通常用于PCR擴增或檢測的DNA是從抗凝血液中提取的，但血液樣本作為DNA來源在一 定程度上受到了限制，主要體現在兩方面，一方面血液保存長時間容易形成凝集，對提取造 成不便;另一方面采集血液也會對人體造成一定的創傷并且還要依靠專業技能才能完成。
[0003] 唾液是一種人體較易獲得的體液，采集更為方便，且無創傷，是理想的體液樣本， 適合大范圍取樣。但唾液成分主要有水、口腔黏膜細胞、細菌、唾液淀粉酶、粘性糖等物質， 成分復雜，不易長時間保存，因此，避免唾液腐敗、保持脫落細胞內基因組DNA完整性對其 應用至關重要。
[0004] 已有專利中的保護劑成分復雜，如專利公布號CN102440234B和CN102919218B， CN102919218B中含有氯化鎂，鎂離子是核酸酶激活劑，不利于DNA的穩定性和完整性的保 存;CN102440234B中含有蛋白質變性劑如異硫氰酸胍，可以抑制核酸酶的活性，但同時也裂 解了細胞，使得DNA處于游離狀態，不利于DNA的完整性保存；CN102919218B和 CN105039306A中分別含有蔗糖和葡萄糖成分，雖然可以很好的保持該唾液保存固定液的粘 度并維持細胞滲透壓，但是容易引起細菌等微生物的滋生;氯化鎂作為核酸酶的激活劑，容 易引起DNA的降解;CN105368812A中成分復雜，尿素、乙醇等成分雖然可以將唾液中的粘蛋 白和球蛋白等有機物質進行變性處理，但同時也會對細胞造成裂解，不利于DNA的完整性 保存，而且在該申請文件中提供的這些成分均為必須成分，即所有成分缺一不可才能穩定 保持唾液DNA的穩定性。
[0005] 針對現有技術的不足，本發明提供一種簡單的人體唾液保存液組方，所述人體唾 液保存液用于保存唾液，能夠長期保持細胞中DNA的完整性，并且能夠避免細菌等微生物的 滋生。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種唾液保存液及其制備方法和用途。
[0007] 本發明實施例提供了一種唾液保存液，包括如下組分和含量：1^8-狀15-80mmol/L，SDS 0.1-4%(w/v)，EDTA l-20mmol/L，氯化鈉50-200mmol/L，體系pH范圍在7-10 之間。
[0008] 可選擇地，上述唾液保存液中，上述TriS-HCl的含量為5-60mmol/L，上述SDS的含 量為0.2-2.8%(w/v)，上述EDTA的含量為l-10mmol/L，上述氯化鈉的含量為90-200mmol/L， 上述體系pH范圍在7-9之間。
[0009] 可選擇地，上述唾液保存液中，上述TriS-HCl的含量為15-50mmol/L，上述SDS的 含量為ο. 3-1.5%(w/v)，上述EDTA的含量為l-5mmol/L，上述氯化鈉的含量為100-180mmol/ L，上述體系pH范圍在7.5-8.5之間。
[0010] 可選擇地，上述唾液保存液中，上述Tris-HCl的含量為40mmol/L，上述SDS的含量 為0.5%(w/v)，上述EDTA的含量為3mmol/L，上述氯化鈉的含量為150mmol/L，上述體系pH范 圍為8。
[0011] 本發明實施例還提供了一種上述唾液保存液的制備方法，上述制備方法包括如下 步驟： a. 稱取如下組分和含量：Tris-HCl 5-80mmol/L，SDS 0.1-4%(w/v)，EDTA l-20mmol/L， 氯化鈉50-200mmol/L，加入無菌水溶解并攪拌均勻；或將各組分分別制備成儲存液的形式 備用，配制時分別量取各組分的體積，混合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至7-10之間，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到上述唾液保存液。
[0012] 可選擇地，上述唾液保存液的制備方法還可以包括如下步驟： a. 稱取各組分：上述Tris-HCl的含量為5-60mmol/L，上述SDS的含量為0.2-2.8%(w/ v)，上述EDTA的含量為l-10mmol/L，上述氯化鈉的含量為90-200mmol/L，加入無菌水溶解并 攪拌均勻；或將各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分的體積，混 合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至7-9之間，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到上述唾液保存液。
[0013] 可選擇地，上述唾液保存液的制備方法還可以包括如下步驟： a. 稱取各組分:上述Tris-HCl的含量為15-50mmol/L，上述SDS的含量為0.3-1.5%(w/ v)，上述EDTA的含量為l-5mmol/L，上述氯化鈉的含量為100-180mmol/L，加入無菌水溶解并 攪拌均勻；或將各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分的體積，混 合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至7.5-8.5之間，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到上述唾液保存液。
[0014] 可選擇地，上述唾液保存液的制備方法還可以包括如下步驟： a. 稱取各組分:上述Tris-HCl的含量為40mmol/L，上述SDS的含量為0.5%(w/v)，上述 Η)ΤΑ的含量為3mmol/L，上述氯化鈉的含量為150mmol/L，加入無菌水溶解并攪拌均勻;或將 各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分的體積，混合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至8，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到上述唾液保存液。
[0015] 本發明實施例還提供了一種上述唾液保存液在保存唾液中的用途。
[0016] 可選擇地，上述唾液為人體唾液。
[0017] 本發明提供的唾液保存液中，其中EDTA組分可以螯合唾液中自身含有的Mg、Ca 等二價陽離子，抑制核酸酶的活性，保證DNA不被降解;其中SDS組分即可以作為變性劑和抑 菌劑，可以將唾液中的粘蛋白和球蛋白等有機物質進行變性處理，在降低液體粘性的同時 使得微生物不易于滋生，可以殺滅或抑制保存后的唾液中的微生物滋生；同時SDS又可以作 為助溶劑，可以與蛋白質形成復合物而增強蛋白質的可溶性;其中NaCl組分可以維持細胞 滲透壓，保護唾液細胞穩定性，同時因不含蔗糖、葡萄糖等糖類進一步減少微生物滋生。其 中Tr is-HCl組分作為緩沖液，可以維持溶液環境pH在7-10、優選7.5-8.5范圍內。本發明的 唾液保存液配方簡單，用于保存人體唾液樣本，能夠在室溫條件下長期保存唾液，所保存的 唾液中DNA完整性好，能夠保證唾液樣本在各采集地之間運輸過程中的穩定性，適用于基因 檢測及相關科學研究。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明實施例1提供的制備的唾液保存液室溫條件保存的同一個人的唾液 樣本在保存不同時間后提取的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，即實施例3的DNA電泳圖，圖 中：M表示DNA Marker(D2000 plus DNA 1^(1(16〇;1-3為唾液樣本室溫保存1周、2周、1個月 后提取得到的DNA; 圖2為本發明實施例4提供的制備的唾液保存液室溫條件保存的同一個人唾液樣本在 保存1周后提取的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中：M表示DNA Marker(D2000 plus DNA Ladder); 1-10為唾液樣本采用配方1-10處理后提取得到的DNA; 圖3為本發明實施例2提供的采集的唾液樣本使用實施例1的唾液保存液保存1周、2周、 1個月后提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增得到的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中：M表示DNA Marker;NA為空白對照，1-3為唾液樣本室溫保存1周、2周、1個月后提取得到的DNA為模板 進行PCR擴增得到的結果，即實施例5的PCR鑒定圖。
【具體實施方式】
[0019] 為了使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案能予以實施，下面結合附圖 和具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
[0020] 實施例1唾液保存液制備 本實施例的唾液保存液包括如下組分和含量：TriS-HCl 40mmol/L，SDSO.5%(w/v)， EDTA3mmol/L，NaC1150mmol/L，體系 pH為 8。
[0021 ]本實施例的唾液保存液的制備方法如下： a. 分別量取 2mL Tris-HCl(lmol/L)、2.5mL SDS(10%)、0.3mL EDTA(0.5mol/L)及 7.5mLNaCl(lmol/L)，依次加入到50ml燒杯中，通過磁力攪拌器混合均勾； b. 用稀鹽酸調整溶液pH值到8; c. 將燒杯中混合液轉移至50ml容量瓶中，并用超純水定容至刻度； d. 用一次性濾膜裝置將上述保存液進行過濾，保存于儲液瓶中。
[0022] 或可選的，其中Tris-HCl儲存液的濃度可以配制成lmol/L備用，SDS儲存液的濃度 可以配制成10% (w/v)備用，EDTA儲存液可以配置成0.5mol/L備用;NaCl儲存液可以配置成 lmol/L備用；配制時分別準確量取各組分儲存液，混合后用鹽酸調節所得混合溶液的pH至 目的范圍，然后用無菌水定容;所得溶液按步驟(d)操作以除菌;步驟(d)微孔濾膜可以選用 孔徑0.45微米以下、優選0.22微米以下的微孔濾膜。
[0023] 實施例2唾液樣本采集與保存 本實施例中唾液樣本米集和保存方法如下： (1) 采樣前30分鐘漱口以除去食物殘渣及殘留微生物，漱口之后30分鐘內不要進食、飲 水、刷牙、吸煙或嚼口香糖； (2) 開始吐唾液前，放松臉頰，并輕輕揉搓15-30秒以產生唾液，將唾液收集到無菌的 2mL EP管中； (3) 按照上述方法采集一個人的唾液2mL; (4) 取與唾液等體積的本實施例制備的唾液保存液加入到唾液樣品中，并顛倒混勻10- 20次； (5) 混勻后樣品可以放置室溫保存，并分別于1周、2周、1個月時提取保存的樣本中的 DNA0
[0024] 實施例3唾液樣本DNA提取 本實施例中唾液樣本DNA的提取方法如下： (1) 取500ul保存過程中的唾液，加入1ml buffer(100mmol/L Tri-HCl，pH8.0, 0.5% SDS，10mmol/L EDTA)和6ul 20mg/ul的蛋白酶K，渦旋儀上震蕩混勻； (2) 將本實施例中上述步驟（1)處理后的唾液進行55 °C水浴處理20min; (3) 加入600ul苯酸:氯仿:異戊醇(25:24:1)，顛倒混勾，1000 Orpm離心5min，取上清； (4) 向本實施例中上述步驟(3)的上清液中加入600ul的氯仿:異戊醇(24:1)，顛倒混 勾后1000 Orpm離心5min，取上清； (5) 向本實施例中上述步驟(4)的上清液體中加入等體積的-20°C預冷的異丙醇，混勻 后沉淀Ih; (6) 將上述液體HOOOrpm離心10min，棄上清； (7) 用500ul70%乙醇洗滌上述沉淀一次，HOOOrpm離心10min，棄上清； (8) 室溫晾干DNA，用30ulEB緩沖液溶解； (9) 取溶解的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。
[0025]結果顯示：唾液樣本室溫保存1周、2周、1個月后提取得到的DNA電泳條帶清晰銳 利，沒有彌散現象。說明使用本實施例制備的唾液保存液能夠維持唾液樣本在室溫條件下 保存至少1個月，并且完整性良好，因此本發明的唾液保存液可用于唾液樣本的長期室溫保 存。
[0026] 實施例4不同唾液保存液組分配方保存的唾液樣本DNA提取 本實施例中按照下表配方配制唾液保存液，并用配制好的唾液保存液保存按照實施例 2的方法采集的唾液樣本，保存1周后，按照實施例3的方法分別提取同一個人的唾液樣本
取溶解的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。
[0027] 結果顯示：根據表格中所給定的各組分的濃度范圍組合得到的配方提取得到的 DNA電泳條帶清晰銳利，沒有彌散現象。說明使用本實施例制備的唾液保存液各組分濃度范 圍隨機組合形成的配方能夠有效提取唾液樣本DNA，并且完整性良好。
[0028] 實施例5 PCR鑒定 本實施例是對從唾液樣本中提取到的基因組DNA進行基因PCR擴增，使用實施例3中采 集的唾液樣本室溫保存1周、2周、1個月后提取得到的DNA作為模板進行PCR擴增，所擴增基 因片段長度為494bp。
[0029] 擴增引物如下： F: 5'-GGGGTCAGAAGCATATCAGTC-3， R: 5，-GGGAAGAACTCAGCGAACT-3， PCR反應程序如下： 95TMmin; 95TMOs，60cC30s，72cC50s，36個循環；72cC2min; 4cC α。
[0030] 結果顯示:擴增出的目的基因片段與預期大小相符，條帶清晰，說明唾液樣本使用 實施例1的唾液保存液保存1個月后提取的基因組DNA完整。
[0031] 以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，本發明的保護范 圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明 的保護范圍之內。本發明的保護范圍以權利要求書為準。
【主權項】
1. 一種唾液保存液，其特征在于包括如下組分和含量：Tris-HCl 5-80mmol/L，SDS Ο · 1 -4%(w/v)，EDTA 1 -20mmo 1 /L，氯化鈉50-200mmo 1 /L，體系pH范圍在7-10之間。2. 根據權利要求1所述的唾液保存液，其特征在于所述Tris-HCl的含量為5-60mmol/L， 所述SDS的含量為0.2-2.8%(w/v)，所述EDTA的含量為1-lOmmol/L，所述氯化鈉的含量為 90-200mmol/L，所述體系pH范圍在7-9之間。3. 根據權利要求2所述的唾液保存液，其特征在于所述Tr i s-HCl的含量為15-50mmo 1/ L，所述SDS的含量為0.3-1.5%(w/v)，所述EDTA的含量為l-5mmol/L，所述氯化鈉的含量為 100-180mmol/L，所述體系pH范圍在7.5-8.5之間。4. 根據權利要求3所述的唾液保存液，其特征在于所述Tris-HCl的含量為40mmol/L， 所述SDS的含量為0.5%(w/v)，所述EDTA的含量為3mmol/L，所述氯化鈉的含量為150mmol/ L，所述體系pH范圍為8。5. -種根據權利要求1所述的唾液保存液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括 如下步驟： 稱取權利要求1所述的唾液保存液的各組分，加入無菌水溶解并攪拌均勻;或將權利要 求1所述的唾液保存液的各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分的 體積，混合； 調節步驟a所得溶液的pH至7-10之間，并用無菌水定容； 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到所述唾液保存液。6. -種根據權利要求2所述的唾液保存液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括 如下步驟： a. 稱取權利要求2所述的唾液保存液的各組分，加入無菌水溶解并攪拌均勻；或將權利 要求2所述的唾液保存液的各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分 的體積，混合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至7-9之間，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到所述唾液保存液。7. -種根據權利要求3所述的唾液保存液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括 如下步驟： a. 稱取權利要求3所述的唾液保存液的各組分，加入無菌水溶解并攪拌均勻；或將權利 要求3所述的唾液保存液的各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分 的體積，混合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至7.5-8.5之間，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到所述唾液保存液。8. -種根據權利要求4所述的唾液保存液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括 如下步驟： a. 稱取權利要求4所述的唾液保存液的各組分，加入無菌水溶解并攪拌均勻；或將權利 要求4所述的唾液保存液的各組分分別制備成儲存液的形式備用，配制時分別量取各組分 的體積，混合； b. 調節步驟a所得溶液的pH至8，并用無菌水定容； c. 將步驟b所得溶液通過微孔濾膜過濾除菌，得到所述唾液保存液。9. 根據權利要求1至4任一所述的唾液保存液在保存唾液中的用途。10. 根據權利要求9所述的用途，其特征在于，所述唾液為人體唾液。
【文檔編號】G01N1/10GK105961375SQ201610546045
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月13日
【發明人】郝淑靜
【申請人】北京中科唯新生物醫學研究所有限公司