雷帕霉素抑制植物早疫病菌的新用圖
【專利摘要】本發明公開了一種雷帕霉素在抑制植物早疫病菌中的應用；還公開了一種真菌殺菌劑：包含雷帕霉素或者雷帕霉素與真菌化學殺菌劑的混合物。本發明首次將用于臨床醫學的TOR蛋白抑制劑雷帕霉素用于植物早疫病的防治研究中，通過研究發現雷帕霉素、雷帕霉素與真菌化學殺菌劑的混合物均能有效地抑制植物早疫病菌，雷帕霉素化學農藥能夠協同作用來抑制植物早疫病菌，為防治早疫病新藥研究提供了非常有意義的基礎，應用于新型殺菌劑的前景廣闊，市場前景好，為防治早疫病提供了一種新的選擇，能夠大幅度減少化學農藥的使用，對降低農藥使用、延緩害蟲抗性的產生具有重要意義，對維持生態系統的平衡和可持續發展也具有重大的應用價值。
【專利說明】
雷帕霉素抑制植物早疫病菌的新用途
技術領域
[0001]本發明涉及雷帕霉素的新用途，尤其涉及雷帕霉素抑制植物早疫病菌的新用途。
【背景技術】
[0002]早疫病，又稱為“輪紋病”或“夏疫病”，屬真菌病害，苗期、成株期均可發病，苗期發病，幼苗的莖基部生暗褐色病斑，稍陷，有輪紋。成株期發病一般從下部葉片向上部發展。初期葉片呈水漬狀暗綠色病斑，擴大后呈圓形或不規則輪紋斑，邊緣具有淺綠色或黃色暈環。中部具同心輪紋，潮濕時病部長出黑色霉層，主要癥狀是病部有(同心)輪紋。早疫病菌能夠感染多種植物，是作物上的重要病原菌，其寄主范圍多樣，除了感染番茄和馬鈴薯外，還可侵染辣椒、茄子、曼陀羅等植物。目前已經報道的引起植物早疫病的病原菌主要有茄鏈格孢菌(Alternaria so Iani)、鏈格抱菌(Alternaria alternate)、Α.interrupta、A.grand is、八.七6]111188；[1]1&、4.(1111]108&、4.&1'130^806118和4.1nfectoria等8種，其中前鏈格抱菌是優勢病原菌，該菌屬半知菌亞門，絲孢綱，鏈格孢屬真菌，成熟菌絲暗褐色，有隔膜和分枝。
[0003]對于早疫病的防治，目前主要是采用以下幾種方式進行，即物理防治、化學防治與生物防治。化學防治是植物保護的主要措施之一，生產上防治早疫病的主要措施是噴施殺菌劑。如保護性殺菌劑銅制劑、波爾多液、代森錳鋅、百菌清、敵菌丹等；內吸性殺菌劑啶酰菌胺、戊唑醇、苯醚甲環唑、嘧菌酯、腐霉利、異菌脲、咯菌腈等。化學農藥的使用，具有一定的生產效果，但是長期使用化學藥劑也帶來了一系列的問題，其中一個是病菌的不斷變異產生的抗藥性，目前早疫病對許多的化學農藥都產生了抗性。另外，由于化學藥劑的使用導致的生態破壞問題也越來越受到人們的關注，急需可以替代化學藥劑的環境友好病害防治體系。
[0004]生物防治，簡單地說就是以蟲治病蟲和以菌治病蟲。植物病害生物防治中常用的微生物有細菌、酵母菌、放線菌和霉菌。由于細菌的基因和代謝產物較為簡單，因此以其作為生防制劑具有很大的潛力。生物防治能夠克服化學藥劑導致的抗藥性以及環境污染問題。目前針對早疫病菌的生物防治研究已經取得了一些進展，如研究發現，木霉代謝產物對茄鏈格孢有抑制作用，合理使用綠膿假單胞桿菌對早疫病的防效與代森錳鋅之間無顯著性差異，熒光假單胞菌、哈茨木霉的培養濾液可有效抑制茄鏈格孢的孢子萌發，大蒜和洋蔥的球莖提取物對早疫病A.alternata的抑制率達50%以上，梁寧等的研究表明枯草芽孢桿菌在防治馬鈴薯早疫病中具有很大的開發潛力。
[0005]T0R(Target ofRapamycin)是一種進化中保守的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，在真菌、動物、植物中通過整合營養和能量信號來促進細胞的增殖和生長。TOR信號通路在動物胚胎形成、分生組織激活，植物根和葉的生長、開花、衰老和生命周期的控制中都扮演著關鍵作用。近幾年研究發現，TOR還具有調節核糖體的生物合成、促進翻譯、新陳代謝調節和抑制自噬的功能。通過RNA干擾技術干擾動植物的TOR基因或tor突變能夠導致胚胎致死，說明TOR基因在動植物的生長發育進程中扮演著核心作用。
[0006]雷帕霉素(Rapamycin，RAP)，又名西羅莫司(Sirolimus)，是一種大環內酯類免疫抑制劑，由吸水鏈霉菌產生，是TOR(Target ofRapamycin)的專性一代抑制劑。它首先特異性的與FKBPl2蛋白結合形成二元復合物，該復合物再與TOR蛋白的FRB結構域結合，從而達到抑制TOR蛋白的活性。當FKBP12基因發生突變時，就會大大降低或者失去與雷帕霉素的結合能力，使得雷帕霉素喪失抑制TOR蛋白的活性。在陸生植物中，FKBP12基因發生了適應性的突變，不能與雷帕霉素進行特異的有效的結合，因此對雷帕霉素表現出了抗性;然而在真菌和哺乳動物中，FKBP12可以與雷帕霉素有效結合形成二元復合物，從而可以抑制其中TOR蛋白的活性，因此真菌和哺乳動物對雷帕霉素表現了較為敏感的性狀。根據這一特性，雷帕霉素可以作為防治植物病蟲害的潛在生物農藥。對雷帕霉素最早的研究主要是將其作為低毒性的抗真菌藥物，尤其是抗白色念珠菌，目前主要廣泛在臨床醫學上用作防止器官移植的排斥反應和治療自身免疫性疾病的免疫抑制劑，利用該化合物來進行植物早疫病的防治還未見相關報道。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是針對以上問題提供一種雷帕酶素抑制植物早疫病菌的新用途。
[0008]為實現上述目的所采用的技術方案是:
[0009]雷帕霉素在抑制植物早疫病菌中的應用。
[0010]在該技術方案中，所述雷帕霉素單獨使用或者與真菌化學殺菌劑混合使用。
[0011]進一步地，所述真菌化學殺菌劑為植物早疫病菌殺菌劑。
[0012]進一步地，所述植物為茄科植物。
[0013]—種真菌殺菌劑，包含雷帕霉素或者雷帕霉素與真菌化學殺菌劑的混合物。
[0014]在該技術方案中，所述真菌化學殺菌劑為植物早疫病菌殺菌劑。
[0015]作為優選地，所述植物早疫病菌殺菌劑為甲霜.噁霉靈。
[0016]作為優選地，所述雷帕霉素的濃度為I?50nmol/L;所述甲霜.噁霉靈的濃度為0.05?0.5mL/L0
[0017]本發明的有益效果是:本發明首次將用于臨床醫學的TOR蛋白抑制劑雷帕霉素用于植物早疫病的防治研究中，通過研究發現雷帕霉素、雷帕霉素與真菌化學殺菌劑的混合物均能有效地抑制植物早疫病菌，雷帕霉素化學農藥能夠協同作用來抑制植物早疫病菌，為防治早疫病新藥研究提供了非常有意義的基礎，應用于新型殺菌劑的前景廣闊，市場前景好，為防治早疫病提供了一種新的選擇，能夠大幅度減少化學農藥的使用，對降低農藥使用、延緩害蟲抗性的產生具有重要意義，對維持生態系統的平衡和可持續發展也具有重大的應用價值。
【附圖說明】
[0018]圖1為經不同濃度甲霜.噁霉靈處理的早疫病菌菌落生長12天情況圖；DMSO為對照。
[0019]圖2為經不同濃度甲霜.噁霉靈處理培養12天后早疫病病菌的菌落直徑示意圖。
[0020]圖3為經不同濃度RAP處理的早疫病菌菌落生長12天情況圖；DMS0為對照。
[0021 ]圖4為經不同濃度RAP處理培養12天后早疫病病菌的菌落直徑示意圖。
[0022]圖5為經不同濃度RAP+甲霜.噁霉靈處理的早疫病菌菌落生長12天情況圖；DMS0為對照。
[0023]圖6為經不同濃度RAP+甲霜.噁霉靈處理培養12天后早疫病菌的菌落直徑示意圖。
[0024]圖7為RAP+甲霜.噁霉靈組合處理早疫病菌得到的協同作用曲線;R= Rapamycin;甲:甲霜.嚼霉靈。
【具體實施方式】
[0025]本發明中所用主要試劑:
[0026]雷帕霉素(Rapamycin):購自美國Selleck Chemicals公司，是一種特定的mTOR抑制劑，目錄號S1039。
[0027]甲霜.噁霉靈為市售常見農藥，有效成分為30%甲霜.噁霉靈，包含6%甲霜靈和24%噁霉靈。
[0028]早疫病菌株alternaria solani購自北京微生物菌種保藏中心。
[0029]所有平板試驗中的固體培養基均為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PotatoDextroseAgar，PDA)。
[0030]分別使用雷帕霉素(RAP)、甲霜.卩惡霉靈、雷帕霉素+甲霜.卩惡霉靈(兩者聯合使用)實驗檢測其對早疫病菌的抑制作用:
[0031]配制PDA培養基，滅菌后置于恒溫水浴中，使其溫度降低并穩定于50°C左右，加入適量體積的藥劑(DMS0或者雷帕霉素或者甲霜.卩惡霉靈或者雷帕霉素+甲霜.嚼霉靈)達到目的終濃度后，倒平板。待平板徹底冷卻凝固后，用打孔器從培養早疫病菌平板(早疫病菌培養方法參照產品說明書進行)的邊緣打取直徑約為5_的早疫病瓊脂塊，置于待測平板中心，于25°C恒溫培養箱黑暗培養，每隔四天觀察一次實驗現象，并拍照記錄，總共持續觀察12天。
[0032]實施例1.用甲霜?噁霉靈單獨處理早疫病菌
[0033]設置甲霜.噁霉靈的濃度梯度為0.05ml/L、0.5ml/L和lml/L，分別配制含有這3種不同濃度的甲霜.噁霉靈的PDA培養基，每個處理設3次重復。培養12天后觀察真菌生長狀況可以發現(如圖1、2所示)，隨著甲霜.噁霉靈濃度的增加，真菌生長受到的抑制越來越明顯。IC50的藥物濃度為0.5ml/L0
[0034]實施例2.用Rapamycin單獨處理早疫病菌
[0035]設置Rapamy c in的濃度梯度為Inmo 1/L、1nmo I/L和50nmo I/L。分別配制含有這3種不同濃度的Rapamycin的PDA培養基，每個處理設3次重復。培養12天后觀察真菌生長狀況可以發現(如圖3、4所示)，隨著Rapamycin濃度的增加，真菌生長受到的抑制越來越明顯。其IC50的藥物濃度約為50nmol/L。
[0036]實施例3.用雷帕霉素+甲霜.噁霉靈組合處理早疫病菌
[0037]雷帕霉素的濃度分別為:lnmOl/L、10nmOl/L、50nmOl/L;甲霜.噁霉靈的使用濃度為0.05ml/L和0.5ml/L。將上述雷帕霉素和甲霜.噁霉靈的濃度分別兩兩組合來處理早疫病菌，共6個組合。分別配制含有這6種不同濃度組合的雷帕霉素+甲霜.噁霉靈的PDA培養基，每個處理設3次重復。培養12天后觀察真菌生長狀況可以發現(如圖5、6所示)，隨著雷帕霉素+甲霜.噁霉靈組合用藥濃度的增加，真菌生長受到的抑制越來越明顯。IC50的藥物濃度為雷帕霉素:50nmol/L+甲霜.噁霉靈:0.05ml/L。雷帕霉素與農藥甲霜.噁霉靈組合使用后達到IC50，農藥甲霜.噁霉靈的使用濃度比單獨使用時降低了 15倍左右。同時，根據CompuSyn軟件計算得到這兩種藥物之間具有協同效應(CI〈1表示具有協同作用;Cl = I表示具有疊加作用;Cl〉I表示具有拮抗作用)，如圖7所示。
【主權項】
1.雷帕霉素在抑制植物早疫病菌中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述雷帕霉素單獨使用或者與真菌化學殺菌劑混合使用。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述真菌化學殺菌劑為植物早疫病菌殺菌劑。4.根據權利要求1至3中任一項所述的應用，其特征在于:所述植物為茄科植物。5.—種真菌殺菌劑，其特征在于:包含雷帕霉素或者雷帕霉素與真菌化學殺菌劑的混合物。6.根據權利要求5所述的真菌殺菌劑，其特征在于:所述真菌化學殺菌劑為植物早疫病菌殺菌劑。7.根據權利要求6所述的真菌殺菌劑，其特征在于:所述植物早疫病菌殺菌劑為甲霜.口惡霉靈。8.根據權利要求5或7所述的真菌殺菌劑，其特征在于:所述雷帕霉素的濃度為I?50nmol/L;所述甲霜.噁霉靈的濃度為0.05?0.5mL/L。
【文檔編號】A01N37/46GK105918330SQ201610348867
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】于力華, 任茂智, 鄭先喆, 張蜀敏, 尹歡
【申請人】重慶大學