一種甘蔗無菌外植體的獲取方法
【專利摘要】本發明提供了一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，包括以下步驟:1)選取甘蔗植株，自肥厚帶向下35?45cm處的地方砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20?35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第三甘蔗莖段；4)用70％?75％的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2?5次，剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段；5)用70％?75％的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2?5次，剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。該方法簡便，效率高，能夠有效簡化甘蔗組培程序，滿足生產需要。
【專利說明】
一種甘蔗無菌外植體的獲取方法
技術領域
[0001]本發明涉及植物組織培養技術領域，具體涉及一種甘蔗無菌外植體的獲取方法。
【背景技術】
[0002]隨著生物技術的發展，植物組織培養技術日趨成熟，在農業上的應用也越來越廣泛。目前眾多的植物都已經通過組織培養進行快速繁殖。甘蔗(Saccharum)既是一種重要的糖料作物也是一種生物質能源作物。甘蔗糖占我國食糖總量的90%以上，甘蔗也是生產乙醇的最佳能源作物。自上世紀70年代，組織培養技術就開始應用于甘蔗培植上，它在甘蔗種苗快速繁殖和脫毒種苗的生產上起著重要的作用。甘蔗系無性繁殖，繁殖系數低，利用組織培養技術，甘蔗能夠在短期內大量繁殖，滿足種苗在生產上的需求。隨著種植年限的延長，甘蔗受到多種病害的侵染，導致品種退化，利用組培技術能夠提純復壯品種。
[0003]外植體的消毒是植物組織培養的第一步，也是最為關鍵的一步，直接關系到試驗的成敗。現有技術中外植體消毒發一般包括氧化汞消毒法和酒精浸泡法。
[0004]氧化汞消毒法，氯化汞是目前植物組織培養中常用的消毒物質。甘蔗外植消毒一般采用氯化汞浸泡的方法，首先在0.1-0.3%的氯化汞溶液中浸泡8-10分鐘，再用無菌水清洗3次以上。該方法步驟繁瑣，耗時長，同時氯化汞是劇毒物質，對外植體傷害比較嚴重，容易導致外植體死亡，丟棄的廢液也容易造成環境污染。
[0005]酒精浸泡法，該方法利用酒精浸泡甘蔗外植體，相比氧化汞消毒法，酒精浸泡法同樣需要用無菌水沖洗材料，比較費時和繁瑣。
【發明內容】
[0006]本發明為了避免現有技術的不足之處而提供了一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，該方法簡便，效率高，能夠有效簡化甘蔗組培程序，滿足生產需要。
[0007]根據本發明所提供的一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，包括以下步驟:
[0008]I)選取甘鹿植株，自肥厚帶向下35_45cm處的地方砍斷所選取的甘鹿植株，取甘鹿尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0009]2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20-35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0010]3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第三甘蔗莖段；
[0011]4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段；
[0012]5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。
[0013]優選地，步驟I)中，所述第一甘蔗莖段的長度為40cm。
[0014]優選地，步驟2)中，所述第二甘蔗莖段的長度為30cm。
[0015]優選地，步驟4)中，用70%酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2次。
[0016]優選地，步驟4)中，用完全浸潤了70%_75%的酒精棉球擦拭第三甘蔗莖段的表面。
[0017]優選地，步驟5)中，用70%酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2次。
[0018]優選地，步驟5)中，用完全浸潤了70 % -75 %的酒精棉球擦拭第四甘蔗莖段的表面。
[0019]優選地，步驟5)在超凈工作臺中進行操作。
[0020]優選地，步驟5)中，還包括切除生長點；用70% -75 %的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉后，切除第四甘蔗莖段的生長點，得到甘蔗無菌外植體。
[0021]為了更好地展示本發明所提供的技術方案，下面對甘蔗葉片作簡單的陳述。甘蔗的葉包括鞘基、葉梢、葉耳、葉舌、肥厚帶(又稱葉環)、葉中脈和葉片。肥厚帶葉又稱“+I葉”，肥厚帶葉的上一葉為“-1葉”，肥厚帶葉以下第I葉為“+2葉”，肥厚帶葉以下第2葉為“+3葉”，依次類推。
[0022]本發明所提供的技術方案可以包括以下有益效果:
[0023](I)本發明所提供的甘蔗無菌外植體的獲取方法，選取甘蔗尾稍為外植體，經過70 %酒精進行表面擦拭消毒，獲得無菌外植體。甘蔗外植體消毒的方法效率高，整個過程能夠在10分鐘內完成，成功率可達到95%以上，完全滿足后續開展甘蔗組織培養的要求。乙醇的使用不僅節約了成本，而且減少了重金屬所帶來的環境污染問題。該方法操作步驟簡單，節約生產時間，對環境和操作者都無毒，本技術可以用于甘蔗健康種苗的無菌培養，甘蔗轉基因愈傷組織的獲得。
[0024](2)本發明所提供的甘蔗無菌外植體的獲取方法，使用酒精作為消毒液，酒精價格便宜且無毒，節約成本，無毒的酒精不會對甘蔗外植體帶來傷害，也不會對生產者造成危害，不污染環境。
[0025](3)本發明所提供的甘蔗無菌外植體的獲取方法，還可以用于甘蔗轉基因育種研究中外植體的獲得，為今后的開展相關研究提供技術基礎。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明實施例1所提供的新臺糖22號無菌外植體的示意圖；
[0027]圖2為本發明實施例2所提供的新臺糖20號無菌外植體的示意圖；
[0028]圖3為本發明實施例3所提供的黑皮果蔗無菌外植體培養后的愈傷組織示意圖；
[0029]圖4為本發明實施例1所提供的新臺糖22號再生植株的示意圖；
[0030]圖5為本發明實施例2所提供的新臺糖20號再生植株的蔗苗示意圖；
[0031]圖6為本發明實施例3所提供的黑皮果蔗無菌外植體培養后的蔗苗示意圖。
【具體實施方式】
[0032 ]下面，結合附圖及【具體實施方式】，對本發明做進一步描述:
[0033]—種甘蔗無菌外植體的獲取方法，包括以下步驟:
[0034]I)選取甘鹿植株，自肥厚帶向下35_45cm處的地方砍斷所選取的甘鹿植株，取甘鹿尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0035]2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20-35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0036]3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第三甘蔗莖段；
[0037]4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段；
[0038]5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。
[0039]實施例1
[0040]一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，所采用的甘蔗莖段選自田間種植的健康生長甘蔗，其品種為新臺糖22號。依次包括如下步驟:
[0041]1、在天氣晴朗時，選取田間種植的甘蔗植株，在距離肥厚帶約40cm處砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0042]2、將第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片剪斷，以肥厚帶為頂端，截取30cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0043]3、逐層剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉(+1葉)和肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)為止，得到第三甘蔗莖段；
[0044]4、用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球對第三甘蔗莖段進行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)，得到第四甘蔗莖段；
[0045]5、在超凈工作臺中，繼續用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球對第四甘蔗莖段進行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉(+ 1葉)，用滅菌后的手術刀切掉第四甘蔗莖段的生長點，即獲得了新臺糖22號無菌外植體，切碎后接種到培養基上。
[0046]如圖1所示，為實施I獲取的新臺糖22號的無菌外植體，經過培養后，其存活率為96%，存活率高，且長勢良好(見圖4)。
[0047]實施例2
[0048]一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，所采用的甘蔗莖段選自田間種植的健康生長甘蔗，其品種為新臺糖20號。依序包括如下步驟:
[0049]1、在天氣晴朗時，選取田間種植的甘蔗植株，在距離肥厚帶約40cm處砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0050]2、將第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片剪斷，以肥厚帶為頂端，截取30cm的莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0051]3、逐層剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉(+1葉)和肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)為止，得到第三甘蔗莖段；
[0052]4、用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球對第三甘蔗莖段進行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)，得到第四甘蔗莖段；
[0053]5、在超凈工作臺中，繼續用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球對第四甘蔗莖段進行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉(+ 1葉)，用滅菌后的手術刀切掉第四甘蔗莖段的生長點，即獲得了新臺糖20無菌外植體，切碎后接種到培養基上。
[0054]如圖2所示，為實施2獲取的新臺糖20號的無菌外植體，經過培養后，其存活率為98%，存活率高，且長勢良好(見圖5)。
[0055]實施例3
[0056]一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，所采用的甘蔗莖段選自田間種植的健康生長甘蔗，其品種為黑皮果蔗。依序包括如下步驟:
[0057]1、在天氣晴朗時，取田間種植的甘蔗植株，在距離肥厚帶約40cm處砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0058]2、將第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片剪斷，以肥厚帶為頂端，截取30cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0059]3、逐層剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉(+1葉)和肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)為止，得到第三甘蔗莖段；
[0060]4、用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球對第三甘蔗莖段進行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)，得到第四甘蔗莖段；
[0061]5、在超凈工作臺中，繼續用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球對第四甘蔗莖段進行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉(+ 1葉)，用滅菌后的手術刀切掉第四甘蔗莖段的生長點，即獲得了黑皮果蔗無菌外植體，可以切碎后接種到培養基上。
[0062]如圖3所示，為實施3獲取的黑皮果蔗的無菌外植體，經過培養后，其存活率為98%，存活率高，且長勢良好(見圖6)。
[0063]對本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應該屬于本發明權利要求的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種甘鹿無菌外植體的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)選取甘蔗植株，自肥厚帶向下35-45cm處的地方砍斷所選取的甘蔗植株，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段； 2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20-35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段； 3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第二甘鹿莖段； 4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2-5次后，剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段； 5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次后，剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。2.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟I)中，所述第一甘蔗莖段的長度為40cmo3.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟2)中，所述第二甘蔗莖段的長度為30cmo4.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟4)中，用70%酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2次。5.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟4)中，用完全浸潤了 70%-75%的酒精棉球擦拭第三甘蔗莖段的表面。6.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)中，用70%酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2次。7.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)中，用完全浸潤了 70 % -75 %的酒精棉球擦拭第四甘蔗莖段的表面。8.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)在超凈工作臺中進行操作。9.根據權利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)中，還包括切除生長點；用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉后，切除第四甘蔗莖段的生長點，得到甘蔗無菌外植體。
【文檔編號】A01H4/00GK105875409SQ201610232287
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月13日
【發明人】王繼華, 曹干, 呂冰
【申請人】廣東省農業科學院作物研究所