一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法
【專利摘要】本發明涉及非酒精性脂肪肝病動物模型的建立，具體為伴有嚴重血脂異常的一類高脂誘導的非酒精性脂肪肝動物模型的建立。選用SPF級雄性AopE?/?小鼠和C57BL/6小鼠，按照鼠種隨機分模型組和對照組，共4組，每組8只，所有小鼠用普通維持飼料適應性喂養1周后，模型組給予高脂飼料，對照組給予對照飼料，10周后取血處死，檢測常規血脂四項及肝功能；取鮮活肝組織勻漿，測定組織內膽固醇與甘油三酯含量；另取肝組織做石蠟、冰凍切片，分別進行H.E.和油紅O染色，判定NAFLD模型效果與質量。本發明使用單純性高脂高熱量飲食造模，在很短的周期10周內造出重度NAFLD模型，模型血脂、肝臟脂肪等指標穩定性極好，可重復性高，為NAFLD高質量模型的建立提供了一種可靠的方法。
【專利說明】
一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法
技術領域
[0001]本發明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)動物模型的建立，具體為伴有嚴重血脂異 常的一類高脂誘導的非酒精性脂肪肝動物模型的建立。
【背景技術】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素以外，導致肝細 胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。NAFLD由一系列連續發展的疾病組成，早 期僅發生單純性脂肪肝(SFL)與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。隨著病變的發展，最終引發肝 組織的纖維化，并導致肝硬化的形成。同時NAFLD所引起的肥胖和血脂異常也是導致其他代 謝障礙性疾病的罪歸禍首，如動脈粥樣硬化(AS)、高血壓和二型糖尿病等。隨著社會的進 步，人們飲食結構發生了改變，大批高脂肪，高膽固醇，高熱量的食物進入了人們的餐桌，伴 隨而來的是我國脂肪肝發病率的不斷提升，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝臟疾病。
[0003] 人們常用各種手段來研究各種疾病，其中最重要的方法之一就是構建動物模型。 為了更全面了解脂肪肝的發生過程，已進行了許多臨床研究。然而，NAFLD病情演變與發展 時間很長，這很大程度上限制我們得到具有合理解釋性的數據。于是，研究者將注意力轉至 發展合適的動物模型方向來探明脂肪肝形成過程。建立一個穩定可靠、病理演變過程符合 的NAFLD動物模型，對研究NAFLD的發病機制及治療方法具有重要意義。
[0004] 現有的非酒精性脂肪肝動物模型類別繁雜，動物選擇上也各有長短，嚙齒類動物 多為SD大鼠、wistar大鼠、C57BL/6小鼠、荷蘭兔等，非嚙齒類動物包括豬、犬等。這些動物模 型雖能在一定程度上反應非酒精性脂肪肝發病進程，但大都存在穩定性差，成模周期長的 特點。本文特別采用以C57BL/6為背景的ApoE-/-基因敲除鼠代替野生型C57BL/6作為研究 對象，ApoE-/-小鼠因為載脂蛋白E的缺乏，導致先天性脂類代謝障礙，小鼠每日攝入充足的 高脂食物不能及時代謝出體外，造成脂質在肝臟的積累。更重要的是，ApoE-/-小鼠模型出 現嚴重的血脂異常，這是脂肪肝發展進程中的一個重要指標，為進一步探討NAFLD和心血管 疾病互為作用的發病機制，提供了一種可靠的方法。
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種利用ApoE-/-小鼠建立經高脂誘導的伴有嚴重血脂異常的單純性 脂肪肝病變動物模型。
[0006] 本發明選用SPF級雄性AopE-/-小鼠和C57BL/6小鼠，按照鼠種隨機分模型組和對 照組，共4組，每組8只。所有小鼠用普通維持飼料適應性喂養1周后，模型組給予高脂飼料， 對照組給予對照飼料，早晚各一次定量定投飼料，保證40g/籠，每籠4只小鼠。10周后取血處 死，檢測常規血脂四項（1'(：、了6、0^-(3、^1-(3)及肝功能以1^和431');取鮮活肝組織勻漿，測 定組織內膽固醇與甘油三酯含量；另取肝組織做石蠟、冰凍切片，分別進行H.E.和油紅0染 色，判定NAFLD模型效果與質量。
[0007] 本發明特點采用以C57BL/6為背景的ApoE-/-基因敲除鼠，經高脂飲食誘導發展形 成非酒精性脂肪肝模型。ApoE-/-小鼠因為載脂蛋白E的缺乏，導致先天性脂類代謝障礙，使 得每日攝食的脂質不能在體內正常運輸，造成其在肝臟中的積累，同時伴有嚴重的血脂異 常，與NAFLD臨床病理相似度極高。C57BL/6小鼠在本發明中作為對照使用。本發明方法中的 動物飼料為對照飼料(ND)和高脂飼料(HFD)均購自江蘇美迪森生物醫藥有限公司。本發明 方法中的SPF級雄性AopE-/-小鼠購自江蘇省常州市卡文斯實驗動物有限公司；SPF級雄性 C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
[0008] 本發明使用單純性高脂高熱量飲食造模，亦可以在很短的周期10周內，造出重度 NAFLD模型。更重要的是，模型血脂、肝臟脂肪等指標穩定性極好，可重復性高。為NAFLD高質 量模型的建立，提供了一種可靠的方法。
【附圖說明】
[0009] 圖1是對照飼料喂養的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖（H.E.染色X400);
[0010]圖2是對照飼料喂養的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖（H.E.染色X400);
[0011]圖3是高脂飼料喂養的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖（H.E.染色X400);
[0012]圖4是高脂飼料喂養的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖（H.E.染色X400);
[0013]圖5是對照飼料喂養的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖（油紅0染色X400);
[0014]圖6是對照飼料喂養的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖（油紅0染色X400);
[0015] 圖7是高脂飼料喂養的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖（油紅0染色X400);
[0016] 圖8是高脂飼料喂養的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖（油紅0染色X400)。
【具體實施方式】
[0017]實施例丨本發明動物模型的制備
[0018] 1、實驗動物：SPF級雄性AopE-/-小鼠，6~8周齡，體重（22 ± 2) g，購自江蘇省常州 市卡文斯實驗動物有限公司【SCXK(蘇UOll-OOShSPF級雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡，體重 (22±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2011-0011】。
[0019] 2、實驗動物均飼養于本部屏障環境內，溫度22~25°C，濕度50%，12小時晝夜交 替。
[0020] 3、實驗動物經適應性喂養1周后，隨機分四組，每組8只，詳細分組情況如下表1。造 模10周，早晚各一次定量定投飼料，保證40g/籠，每籠4只小鼠，期間自由引水，水源為SPF級 的滅菌水，每兩周稱量體重一次。動物飼料為對照飼料(MD12031)和高脂飼料(MD12032)均 購自江蘇美迪森生物醫藥有限公司。
[0021] 表1動物詳細分組
[0023] 4、造模10周后，各組小鼠同一時間全部處死，處死前禁食12小時。4%水合氯醛腹 腔注射麻醉，摘眼球取血后，全血37°C靜置1小時，4°C放置血塊析出，3000rmp離心10min取 上層血清。全自動生化分析儀檢測血清中的TC、TG、LDL-c、HDL-c、AST和ALT等指標，結果如 表2所示。
[0024] 表2各組血清生化指標變化表(^±s、n = 6)
[0026]注：TC、TG、LDL-C和HDL-C單位為mmol/L，AST和ALT單位為U/Ua:與A組比較，P〈 0.01;b:與 B組比較，P〈0.01;c:與C組比較，P〈0.01。
[0027]高脂飼料喂養的AopE-/-小鼠組相較于其他三組TC、TG和LDL-C均有極顯著上升(P 〈0.01);高脂飼料喂養的C57BL/6小鼠組相較于對照飼料喂養的C57BL/6小鼠組TC、TG和 LDL-C均有極顯著降上升（P〈0.01)但數值相較差距不大；有趣的是同是對照飼料喂養的 AopE-/-小鼠組相較于對照飼料喂養的C57BL/6小鼠組TC、TG和LDL-C均有極顯著降上升(P〈 0.01)且數值差距較大。各組間血清中AST和ALT指標沒有顯著性差異，顯示出高脂誘導10 周，各組肝臟沒有較大損傷，根據NAFLD病情發展判斷，本發明中模型應為單純性脂肪肝。以 上數據表明ApoE-/-小鼠在血清脂質提升上的優勢比較明顯。
[0028] 5、肝臟脂質的檢測，具體方法以一只小鼠為例，分別各取100mg新鮮肝組織根據試 劑盒自帶裂解液各加lml進行勻漿，各自勻漿液一部分用來檢測甘油三酯(TG)和總膽固醇 (TC)的含量，另一部分分別測定其蛋白含量，最后必須用每毫克蛋白濃度來校正甘油三酯 (TG)和總膽固醇。甘油三酯（組織)酶法測定試劑盒(E1013)和總膽固醇（組織)含量測定試 劑盒(E1015)購自北京普利萊基因技術有限公司。結果如表3所示。
[0029]表3各組肝臟脂質變化表(S±s ,n = 6)
[0031] 注：TC和TG的單位為mmol/kga:與A組比較，P〈0 ? 01;b:與B組比較，P〈0 ? 01; c :與C 組比較，P〈〇.〇l。
[0032] 與血脂對應的是ApoE-/-小鼠肝臟脂質蓄積比較嚴重，其中高脂飼料喂養的 AopE-/-小鼠組相較于其他三組，肝臟TG和TC上升明顯（P〈0.01)，高脂飼料喂養的C57BL/6 小鼠組相較于對照飼料喂養的C57BL/6小鼠組肝臟TG和TC上升也是比較明顯(P〈0.01)說明 C57BL/6小鼠高脂誘導成功，但效果遜于ApoE-/-小鼠。
[0033] 6、肝臟組織病理學的檢測，具體方法以一只小鼠為例，取肝臟同一部位，分兩份。
[0034] 6a、一部分用Bouin ' S固定液固定，用作石錯切片進行H. E.染色。
[0035] 6b、另一部分用4%多聚甲醛固定液固定，用作冰凍切片進行油紅0染色。
[0036]由病理切片可以看出，對照飼料喂養的C57BL/6小鼠肝組織結構緊湊，放射性肝鎖 結構清晰，細胞核質飽滿（圖1和5);對照飼料喂養的AopE-/-小鼠肝組織結構依舊清晰，但 細胞外周已出現輕微的脂肪侵潤，應發展至輕度脂肪肝(圖2和6);高脂飼料喂養的C57BL/6 小鼠組肝細胞內已發生脂肪病變，出現空泡面積已達1/2以上，應發展為中度脂肪肝（圖3和 7);高脂飼料喂養的AopE-/-小鼠組，已經出現嚴重的肝細胞脂肪彌漫集聚，呈大脂滴樣，已 發展為重度脂肪肝(圖4和8)。進一步說明基因敲除ApoE-/-小鼠NAFLD模型的成功。
[0037]綜上所述，利用ApoE-/-小鼠經高脂誘導成功建立了伴有嚴重血脂異常的非酒精 性脂肪肝NAFLD動物模型。為研究NAFLD發病機理尤其是NAFLD與心血管疾病脂質代謝異常 所形成的相互作用提供了一種新型動物模型。
【主權項】
1. 一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法，期特征在于，建立模型的步 驟為： 1) 、選取鼠種：分別選取SPF級雄性ΑορΕ-/-小鼠，6~8周齡，體重22 ± 2g，SPF級雄性 C57BL/6小鼠，6~8周齡，體重22±2g，飼養于本部屏障環境內，溫度22~25°C，濕度50%，12 小時晝夜交替，適應性喂養1周； 2) 、分組與造模:經適應性喂養1周后，隨機分四組，其中ΑορΕ-/-小鼠兩組，命名為對照 組Β和高脂組D，C57BL/6小鼠兩組，命名為對照組Α和高脂組C，每組8只；造模10周，期間對照 組喂食對照飼料，高脂組喂食高脂飼料，早晚各一次定量定投飼料，保證40g/籠，每籠4只小 鼠，自由引水，水源為SPF級的滅菌水，每兩周稱量體重一次； 3) 、采血與檢測：造模10周后，各組小鼠同一時間全部處死，處死前禁食12小時，4%水 合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球取血后，全血37°C靜置1小時，4°C放置血塊析出，3000rmp離心 1 Omin取上層血清，全自動生化分析儀檢測血清中的TC、TG、LDL-c、HDL-c、AST和ALT指標； 4) 、肝臟脂質的檢測：各組以一只小鼠為例，分別各取100mg新鮮肝組織根據試劑盒自 帶裂解液各加lml進行勻漿，各自勻漿液一部分用來檢測甘油三酯TG和總膽固醇TC的含量， 另一部分分別測定其蛋白含量，最后必須用每毫克蛋白濃度來校正甘油三酯TG和總膽固醇 TC； 5) 、肝臟組織病理學的檢測：各組以一只小鼠為例，取肝臟同一部位，分兩份，一部分用 Bouin's固定液固定，用作石錯切片進行H.E.染色，另一部分用4%多聚甲醛固定液固定，用 作冰凍切片進行油紅〇染色； 6) 、對步驟3)-步驟5)進行分析，確定利用ApoE-/-小鼠經高脂誘導成功建立了伴有嚴 重血脂異常的非酒精性脂肪肝NAFLD動物模型。
【文檔編號】A23K50/50GK105850868SQ201610189192
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月28日
【發明人】劉慶平, 路遙, 林家彬, 王仁軍
【申請人】大連大學