一種快速繁殖雞蛋花種苗的方法
【專利摘要】本發明屬植物栽培技術領域，涉及一種快速繁殖雞蛋花種苗的方法，是取紅花雞蛋花帶芽的、去葉的莖尖或莖段，切成小段經消毒滅菌后，利用改良的MS培養基進行不定芽的誘導、增殖培養、壯苗培養、生根培養，然后進行煉苗，移栽控溫大棚培育。本發明以帶芽的紅花雞蛋花莖段作為外植體，在不經愈傷組織階段進行快速繁育，所得紅花雞蛋花種苗能夠保持原品種的優良性狀，遺傳性狀穩定，變異小，具有操作簡單、成本低、生長速度快、周期短、繁殖率高等特點，是一種雞蛋花以芽繁芽的無菌快繁體系，為雞蛋花繁育和產業化生產奠定基礎。
【專利說明】
一種快速繁殖雞蛋花種苗的方法
技術領域
[0001 ]本發明屬植物栽培技術領域，涉及一種雞蛋花種苗的繁殖方法，具體是一種以雞 蛋花莖段作為外植體進行快速繁殖種苗的方法。
【背景技術】
[0002] 雞蛋花(Plumeria rubra L.cv.Acutifolia)，屬夾竹桃科雞蛋花屬落葉灌林或喬 木，喜濕熱氣候，原產于墨西哥等美洲熱帶地區，現廣植于亞洲熱帶及亞熱帶地區，國內主 產于福建、廣東、廣西、云南、海南等地。雞蛋花樹形優美，樹冠半球形，葉似枇杷，大而青綠， 花色素雅，芳香，且花型奇特，是優良的庭院樹種，既可在庭園、草地栽植觀賞，也可盆栽，鮮 切花可用于插花或制作花束、花籃等。
[0003] 雞蛋花干燥花朵為廣東地區常用藥材，是廣東涼茶"五花茶"的主要原料之一，有 清熱解暑、利濕、止咳的功效，用于濕熱下痢，肺熱咳嗽等。雞蛋花含有雞蛋花酸(plumeric acid)、甙類及揮發油，氣味芳香，可提取香精應用于日用化妝品行業。
[0004] 雞蛋花的常規繁殖方法是利用種子繁殖，也有采用扦插、壓條、嫁接等方式繁殖， 但其繁殖速度慢、周期長，遠遠不能滿足產業化的需求。目前，有相關研究人員嘗試利用組 培技術進行快速繁殖雞蛋花的相關研究，如專利CN103444540A公開了一種組織培養快速繁 育紅花雞蛋花的方法，其以紅雞蛋花葉片為外植體，在誘導形成愈傷組織后，再經愈傷組織 分化、芽增殖和生根培養，形成完整植株小苗，最后進行煉苗和移栽。然而，其以葉片作為外 植體，因葉片大多由已分化的細胞組成，其再生成植株通常需要經歷從分化狀態恢復到分 生組織狀態的脫分化過程，而經脫分化的細胞在一定條件下經愈傷組織階段再分化出芽或 胚狀體而形成植株時，其后代易發生變異，導致獲得的植株遺傳學特性不穩定。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的提供一種快速繁殖雞蛋花種苗的方法，以雞蛋花莖段作為外植體進 行組織培養，在不經過愈傷組織階段實現種苗快速繁殖，且能保證其遺傳學特性，減少玻璃 化發生率，以滿足城市綠化美化對雞蛋花種苗的需求。
[0006] 本發明所采用的技術方案：
[0007] -種快速繁殖雞蛋花種苗的方法，其步驟如下：
[0008] 1)外植體的取材與消毒：取紅花雞蛋花帶芽的、去葉的莖尖或莖段，切成長1~ 1.5cm、帶2~3個腋芽的小段作為外植體，消毒滅菌后得到無菌外植體。
[0009] 所述紅花雞蛋花外植體的消毒過程是：首先用自來水流水沖洗，然后用75%酒精 浸泡8~15 s，再放入0.1 % H g C12溶液消毒滅菌10~15 m i n，消毒滅菌液中加入2~3滴吐溫-20,最后用無菌水沖洗3~5次，得到無菌外植體。
[0010] 2)誘導分化不定芽:將經消毒的外植體接種至誘導培養基中進行不定芽的誘導培 養，培養條件:溫度為24~26°C，光照強度為1500~25001x，光照時間為10~12h/d;培養30 天后，外植體分化出不定芽。所述誘導培養基是以MS培養基為基本培養基，并添加6- BAO ? 5mg/L、NAA 0 ? 02mg/L、鹿糖30g/L、卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8。
[0011] 3)不定芽增殖培養:切取不定芽接種于增殖培養基中進行培養，培養條件:溫度為 24~26°C，光照強度為1500~25001x，光照時間為10~12h/d;培養30天后獲得大量的叢生 芽。所述增殖培養基是以MS培養基為基本培養基，并添加6-BA 2~3mg/L、NAA0.2~0.5mg/ L、鹿糖30g/L、卡拉膠 6 ? 5g/L，pH為5 ? 8。
[0012] 4)壯苗培養:將叢生芽接種至壯苗培養基中進行壯苗培養，培養條件:溫度為24~ 26°C，光照強度為1500~25001x，光照時間為10~12h/d。所述壯苗培養基是以MS培養基為 基本培養基，并添加蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH為5.8。
[0013] 5)試管苗生根培養:待經壯苗培養的不定芽生長到2~3cm時，將不定芽叢進行單 株分離，接種到生根培養基上進行生根培養，培養條件:溫度為24~26°C，光照強度為1500 ~25001x，光照時間為10~12h/d;培養30天后形成良好根系，獲得完整植株。所述生根培養 基是以1/2MS培養基為基本培養基，并添加NAA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠 6.5g/L，pH為5.8;
[0014] 6)試管苗煉苗移栽:將生根苗移至室外煉苗7~10天后取出，洗凈小苗根部的培養 基，并在0.1%的高錳酸鉀溶液中進行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土的基質中，并 放于控溫大棚內進行培育。
[0015] 本發明以帶芽的紅花雞蛋花莖段作為外植體，在不經愈傷組織階段進行快速繁 育，所得紅花雞蛋花種苗能夠保持原品種的優良性狀，遺傳性狀穩定，變異小，具有操作簡 單、成本低、生長速度快、周期短、繁殖率高等特點，是一種雞蛋花以芽繁芽的無菌快繁體 系，為雞蛋花繁育和產業化生產奠定基礎。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于 說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常 按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0017] 一、紅花雞蛋花種苗繁殖
[0018] 實施例一
[0019] 1、外植體的取材與消毒：于2015年5月在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源 研究所基地，選取處于生長旺盛時期的紅花雞蛋花植株，采集當年生、有飽滿而未萌發的腋 芽的嫩枝作為外植體。取帶芽的、去葉的莖尖，切成長1.2cm、帶2~3個腋芽的小段，一共切 取100段作為外植體放在l〇〇ml三角瓶進行消毒:首先用自來水流水沖洗lOmin，用75%酒精 浸泡l〇s，再放入0.1 %HgCl2溶液消毒滅菌12min，消毒滅菌液中加入2滴吐溫-20,最后用無 菌水沖洗3次，得到無菌外植體。
[0020] 2、誘導分化不定芽：將經消毒的外植體接種至誘導培養基(MS+6-BA 0.5mg/L+ NAA0.02mg/L+鹿糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH為5.8)中進行不定芽的誘導培養，培養條件:溫 度為25°C，光照強度為18001x，光照時間為10h/d;培養30天后，外植體分化出不定芽。
[0021] 3、不定芽增殖培養:將分化出不定芽的莖尖細切成含有2個不定芽的小段200段， 接種于增殖培養基(MS+6-BA 2mg/L+NAA0 ? 3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8)中進 行培養，培養條件:溫度為24°C，光照強度為16001x，光照時間為12h/d;培養30天后獲得大 量的叢生芽。
[0022] 4、壯苗培養：將叢生芽接種至壯苗培養基(MS+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH為 5.8) 中進行壯苗培養，培養條件:溫度為25°C，光照強度為18001x，光照時間為1 lh/d。
[0023] 5、試管苗生根培養:待經壯苗培養的不定芽生長到2~3cm時，單株切取400株，接 種到生根培養基（1/2MS+NAA 1 ? Omg/L+IBA 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8) 上進行生根培養，培養條件:溫度為25°C，光照強度為20001x，光照時間為12h/d;培養30天 后形成良好根系，獲得完整植株。
[0024] 6、試管苗煉苗移栽:將300株根系完整的生根苗移至室外煉苗8天后取出，洗凈小 苗根部的培養基，并在0.1%的高錳酸鉀溶液中進行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土 的基質中，于控溫大棚內進行培育。
[0025] 實施例二
[0026] 1、外植體的取材與消毒:于2015年6月中旬在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種 資源研究所基地，選取處于生長旺盛時期的紅花雞蛋花植株，采集當年生、有飽滿而未萌發 的腋芽的嫩枝作為外植體。取帶芽的、去葉的莖段，切成長1.5cm、帶2~3個腋芽的小段，一 共切取100段作為外植體放在l〇〇ml三角瓶進行消毒:首先用自來水流水沖洗lOmin，用75 % 酒精浸泡13s，再放入0.1 %HgCl2溶液消毒滅菌12min，消毒滅菌液中加入3滴吐溫-20，最后 用無菌水沖洗4次，得到無菌外植體。
[0027] 2、誘導分化不定芽：將經消毒的外植體接種至誘導培養基(MS+6-BA 0.5mg/L+ NAA0.02mg/L+鹿糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH為5.8)中進行不定芽的誘導培養，培養條件:溫 度為26°C，光照強度為22001x，光照時間為12h/d;培養30天后，外植體分化出不定芽。
[0028] 3、不定芽增殖培養:將分化出不定芽的莖段細切成含有2個不定芽的小段200段， 接種于增殖培養基(MS+6-BA 3mg/L+NAA0 ? 3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8)中進 行培養，培養條件:溫度為24°C，光照強度為21001x，光照時間為12h/d;培養30天后獲得大 量的叢生芽。
[0029] 4、壯苗培養：將叢生芽接種至壯苗培養基(MS+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH為 5.8) 中進行壯苗培養，培養條件:溫度為24°C，光照強度為2500lx，光照時間為1 Oh/d。
[0030] 5、試管苗生根培養:待經壯苗培養的不定芽生長到2~3cm時，單株切取400株，接 種到生根培養基（1/2MS+NAA 1 ? Omg/L+IBA 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8) 上進行生根培養，培養條件:溫度為26°C，光照強度為18001x，光照時間為10h/d;培養30天 后形成良好根系，獲得完整植株。
[0031] 6、試管苗煉苗移栽:將300株根系完整的生根苗移至室外煉苗10天后取出，洗凈小 苗根部的培養基，并在0.1%的高錳酸鉀溶液中進行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土 的基質中，于控溫大棚內進行培育。
[0032] 實施例三
[0033] 1、外植體的取材與消毒:于2015年7月中旬在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種 資源研究所基地，選取處于生長旺盛時期的紅花雞蛋花植株，采集當年生、有飽滿而未萌發 的腋芽的嫩枝作為外植體。取帶芽的、去葉的莖段，切成1.3cm長、帶2~3個腋芽的小段，一 共切取100段作為外植體放在l〇〇ml三角瓶進行消毒:首先用自來水流水沖洗10min，用75 % 酒精浸泡15s，再放入0.1 %HgCl2溶液消毒滅菌12min，消毒滅菌液中加入2滴吐溫-20，最后 用無菌水沖洗5次，得到無菌外植體。
[0034] 2、誘導分化不定芽：將經消毒的外植體接種至誘導培養基(MS+6-BA 0.5mg/L+ NAA0.02mg/L+鹿糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH為5.8)中進行不定芽的誘導培養，培養條件:溫 度為25°C，光照強度為24001x，光照時間為10h/d;培養30天后，外植體分化出不定芽。
[0035] 3、不定芽增殖培養:將分化出不定芽的莖段細切成含有2個不定芽的小段200段， 接種于增殖培養基(MS+6-BA 2mg/L+NAA0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8)中 進行培養，培養條件:溫度為26°C，光照強度為2400lx，光照時間為10h/d;培養30天后獲得 大量的叢生芽。
[0036] 4、壯苗培養：將叢生芽接種至壯苗培養基(MS+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH為 5.8)中進行壯苗培養，培養條件:溫度為26°C，光照強度為21001x，光照時間為1 lh/d。
[0037] 5、試管苗生根培養:待經壯苗培養的不定芽生長到2~3cm時，單株切取400株，接 種到生根培養基（1/2MS+NAA 1 ? Omg/L+IBA 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠6 ? 5g/L，pH為5 ? 8) 上進行生根培養，培養條件:溫度為25°C，光照強度為24001x，光照時間為12h/d;培養30天 后形成良好根系，獲得完整植株。
[0038] 6、試管苗煉苗移栽:將300株根系完整的生根苗移至室外煉苗7天后取出，洗凈小 苗根部的培養基，并在0.1%的高錳酸鉀溶液中進行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土 的基質中，于控溫大棚內進行培育。
[0039]二、種苗繁殖效果鑒定
[0040] 1.紅花雞蛋花外植體不定芽誘導效果鑒定
[0041] 為鑒定紅花雞蛋花外植體的誘導效果，對上述實施例的不定芽誘導情況進行觀 察，統計不定芽誘導數，計算誘導率，結果見表1。
[0042] 表1紅花雞蛋花外植體誘導情況
[0044] 上述紅花雞蛋花外植體不定芽誘導效果表明，本發明以改良的MS培養基進行不定 芽誘導，誘導率達80%以上，具有較好的分化效果。
[0045] 2.紅花雞蛋花不定芽增殖效果鑒定
[0046] 為鑒定紅花雞蛋花不定芽的增殖效果，對上述實施例的不定芽的增殖情況進行觀 察，統計增殖數，計算增值系數，結果見表2。
[0047]表2不定芽的增殖情況
[0050]上述不定芽增殖效果表明，本發明以改良的MS培養基進行不定芽增殖，增殖系數 達到5.0以上，增殖效果明顯。
[0051] 3.不定芽生根效果鑒定
[0052]為鑒定不定芽的生根效果，對上述實施例的不定芽生根情況進行觀察，統計生根 數，計算生根率，結果見表3。
[0053]表3不定芽的生根情況
[0055]上述不定芽生根效果表明，本發明以改良的MS培養基對不定芽進行誘導生根，在 短時間內（1個月左右)誘導出完整根系，生根率達90%以上。
[0056] 4.生根苗苗圃移栽效果鑒定
[0057]為鑒定生根苗的移栽成活效果，對上述實施例的生根苗苗圃移栽生長情況進行觀 察，統計成活數，計算生根率，結果見表4。
[0058]表4生根苗的移栽生長情況
[0060] 上述移栽效果表明，本發明以誘導出良好根系的生根苗進行苗圃移栽，以椰糠和 腐殖土的混合物為栽培基質，具有較高的生根苗移栽成活率，達到90%以上，可以滿足批量 種苗繁殖，為雞蛋花繁育和產業化生產奠定基礎。。
[0061] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種快速繁殖雞蛋花種苗的方法，其特征在于，其步驟如下： 1) 外植體的取材與消毒：取紅花雞蛋花帶芽的、去葉的莖尖或莖段，切成長1~1.5cm、 帶2~3個腋芽的小段作為外植體，消毒滅菌后得到無菌外植體； 2) 誘導分化不定芽:將經消毒的外植體接種至誘導培養基中進行不定芽的誘導培養， 培養條件:溫度為24~26°C，光照強度為1500~25001x，光照時間為10~12h/d;培養30天 后，外植體分化出不定芽；所述誘導培養基是以MS培養基為基本培養基，并添加6-BA 0 · 5mg/L、NAA0 · 02mg/L、鹿糖30g/L、卡拉膠 6 · 5g/L，pH為5 · 8; 3) 不定芽增殖培養:切取不定芽接種于增殖培養基中進行培養，培養條件:溫度為24~ 26°C，光照強度為1500~25001x，光照時間為10~12h/d;培養30天后獲得大量的叢生芽;所 述增殖培養基是以MS培養基為基本培養基，并添加6-BA 2~3mg/L、NAA0.2~0.5mg/L、蔗糖 30g/L、卡拉膠 6.5g/L，pH為5.8; 4) 壯苗培養:將叢生芽接種至壯苗培養基中進行壯苗培養，培養條件:溫度為24~26 °C，光照強度為1500~25001x，光照時間為10~12h/d;所述壯苗培養基是以MS培養基為基 本培養基，并添加蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH為5.8; 5) 試管苗生根培養:待經壯苗培養的不定芽生長到2~3cm時，將不定芽叢進行單株分 離，接種到生根培養基上進行生根培養，培養條件：溫度為24~26°C，光照強度為1500~ 25001x，光照時間為10~12h/d;培養30天后形成良好根系，獲得完整植株;所述生根培養基 是以1/2MS培養基為基本培養基，并添加NAA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠 6.5g/L，pH為5.8; 6) 試管苗煉苗移栽:將生根苗移至室外煉苗7~10天后取出，洗凈小苗根部的培養基， 并在0.1%的高錳酸鉀溶液中進行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土的基質中，并放于 大棚內進行培育。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述紅花雞蛋花外植體的消毒過程是：首 先用自來水流水沖洗，然后用75 %酒精浸泡8~15s，再放入0.1 % HgC 12溶液消毒滅菌10~ 15min，消毒滅菌液中加入2~3滴吐溫-20,最后用無菌水沖洗3~5次，得到無菌外植體。
【文檔編號】A01H4/00GK105850742SQ201610279094
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】李克烈, 李志英, 徐立, 符運柳, 黃碧蘭
【申請人】中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所