基于花器官發育的鐵皮石斛制種法及相應的獲得方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于花器官發育的鐵皮石斛制種法：取開花第8～14d的花藥授粉到開花第8～21d的柱頭上。本發明還提供了一種獲得上述鐵皮石斛制種法的方法，包括如下步驟：1)、待鐵皮石斛枝條初現花苞時，掛牌；2)、摘取同一總狀花序內整個花期不同開花天數的小花；3)、采用TTC染色法測定整個花期不同開花天數的小花花藥的活力；4)、采用聯苯胺?過氧化氫法測定整個花期不同開花天數的小花柱頭的可授性；5)、在同一總狀花序內，選擇花藥活力強的花藥授粉到可授性強的柱頭。依照上述方法，150天左右，可獲得遺傳背景一致、高坐果率的蒴果。
【專利說明】
基于花器官發育的鐵皮石斛制種法及相應的獲得方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種基于花器官發育的鐵皮石斛制種方法。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是我國傳統名貴中藥材，具 有益胃生津、滋陰清熱等獨特的功效。早在秦漢時期，《神農本草經》就記載鐵皮石斛"主傷 中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃"；1000多年前的《道藏》將鐵皮石斛列為 "中華九大仙草"之首;李時珍在《本草綱目》中評價鐵皮石斛"強陰益精，厚腸胃，補內絕不 足，平胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年"；民間稱其為救命仙草，國際藥用植物界稱為"藥 界大熊貓"。現代藥理研究證明，鐵皮石斛具有增強免疫力、抑制癌癥等作用。為此，2010版 《中華人民共和國藥典》特將鐵皮石斛單獨收載。20世紀90年代以前，鐵皮石斛主要依靠野 生資源，由于自然條件下種子萌發困難、生長發育緩慢，加上人們長期以來對之進行毀滅性 采挖與生存環境的破壞，使其野生資源處于瀕臨滅絕，國際社會將其列入《瀕危野生植物國 際貿易公約CITES》，我國也將鐵皮石斛列為國家二級保護瀕危植物。
[0003] 近年來，隨著種植、加工技術的突破，鐵皮石斛種植面積出現了 "井噴式"的增長， 2015年，全國藥用石斛種植面積高達50000余畝，而且種植面積持續增加，每畝需種苗8萬株 左右，種苗的需求量大，目前鐵皮石斛的種苗繁育絕大多數采用人工授粉、依賴于組織培養 的實生種苗繁育生產工藝。但當前我國對鐵皮石斛等蘭科植物的育種研究理論基礎薄弱， 制種不規范(遺傳背景不同的材料間進行授粉制種)造成了品種混雜、種性不穩，品質不一， 這些原植物品種上的藥用成分差異最終導致藥材藥效不穩，嚴重阻礙了鐵皮石斛的進一步 開發利用，成為產業發展的瓶頸。而鐵皮石斛總狀花序的特質，即每朵小花都有一個花柄與 花軸有規律地相連，在整個花軸上有不同發育程度的花朵，有效保障了遺傳背景一致的親 本材料。為此開展基于鐵皮石斛花器官發育的制種模式，可以得到大量遺傳背景一致的蒴 果，有效解決種源的遺傳穩定性問題，將有助于提供遺傳背景一致、藥用成分相同、藥效穩 定的優質種苗。
[0004] 當前我國對鐵皮石斛的育種研究理論基礎薄弱，制種不規范。許多企業直接在不 同品種、株系和來源等遺傳背景不同的鐵皮石斛間進行授粉制種，造成了品種混雜、種性不 連心穩，品質不一。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種基于花器官發育的鐵皮石斛制種方法，采用 該方法能獲得大量遺傳背景一致的蒴果，有效解決種源的遺傳穩定性問題，將有助于提供 遺傳背景一致、藥用成分相同、藥效穩定的優質種苗。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種基于花器官發育的鐵皮石斛制種法:取 開花第8~14d的花藥授粉到開花第8~21d的柱頭上。
[0007] 本發明還同時提供了獲得上述鐵皮石斛制種法的方法，包括如下步驟：
[0008] 1)、待鐵皮石斛枝條初現花苞時，掛牌(即，作標記）；
[0009] 2)、摘取同一總狀花序內整個花期不同開花天數的小花；
[0010] 3)、采用 TTC(2,3,5 -氯化三苯基四氮唑，2,3,5，Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride)染色法測定整個花期不同開花天數的小花花藥的活力；
[0011] 4)、采用聯苯胺-過氧化氫法測定整個花期不同開花天數的小花柱頭的可授性；
[0012] 5)、在同一總狀花序內，選擇花藥活力強的花藥授粉到可授性強的柱頭。
[0013] 依照上述方法，150天左右，可獲得遺傳背景一致、高坐果率的蒴果。
[0014] 備注說明：在本發明中，根據染色結果，建立花藥和柱頭的發育時間表，取花藥活 力強的花藥授粉到可授性強的柱頭上。
[0015] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的改進：
[0016] 在步驟1)之后，
[0017]選取一個枝條上的總狀花序進行如下操作:記載該總狀花序內，每一朵小花從花 苞形成開始到花朵凋謝結束時的整個花期；
[0018] 同時，選取另一個枝條上的總狀花序進行上述步驟2)~步驟5)。
[0019] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進：
[0020] 所述步驟3)中的TTC染色法測定為:取出鐵皮石斛小花藥帽里的花藥，置于離心管 內，加TTC染液沒過花藥，37°C避光孵育15~30min后，棄染液，用無菌水漂洗花藥，吸水紙吸 干表面水分;將染色后的花藥置于體視變焦顯微鏡下觀察拍照；花藥染成紅色越深表明活 力越強。
[0021] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進：
[0022] 所述TTC染液的制備方法為:將0.5g的TTC用O.lmol/L pH 7.5的磷酸緩沖液斤85) 溶解并定容至l〇〇ml，從而配制成濃度為0.5%的TTC染色液。
[0023]備注說明：TTC染液需避光保存，若發紅則不能再用。
[0024] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進：
[0025] 所述步驟4)的聯苯胺-過氧化氫法測定為：將小花朵連花柄采下，去掉所有花瓣 (去除花藥）；用解剖刀沿隔膜切開合蕊柱，去掉雄蕊露出柱頭窩；將柱頭窩置于載玻片上， 滴加2~3滴聯苯胺-過氧化氫反應液于柱頭窩上;將載玻片迅速置于體視變焦顯微鏡下觀 察拍照;柱頭四周的反應液呈現藍色越深、氣泡量越多表明柱頭的可授性越強。
[0026] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進：
[0027] 聯苯胺-過氧化氫反應液的制備方法為:將質量濃度為1 %聯苯胺溶液、體積濃度 為3%過氧化氫溶液、蒸餾水按照4:11:22的體積比配制而得。
[0028] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進:所述步驟5)中，每個總 狀花序授粉3~5朵花。即，每一個枝條做3-5朵花的授粉。
[0029] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進:所述步驟1)的掛牌為： 在初現花苞的枝條基部掛上標簽。
[0030] 作為本發明的獲得鐵皮石斛制種法的方法的進一步改進:將掛牌的枝條，每天拍 照跟蹤或者圖示文字記錄整個總狀花序內每一朵小花從花苞形成開始到花朵凋謝結束時 的整個花期。
[0031] 本發明的基于花器官發育的鐵皮石斛制種方法，是依據鐵皮石斛總狀花序的特 質，即每朵小花都有一個花柄與花軸有規律地相連，在整個花軸上有不同發育程度的花朵， 這為鐵皮石斛同一小花內花藥和柱頭發育不同步提供了有效的物質基礎，有效保障了遺傳 背景一致的親本材料。為此開展基于鐵皮石斛花器官發育的制種模式，可以得到大量遺傳 背景一致的蒴果，有效解決種源的遺傳穩定性問題，將有助于提供遺傳背景一致、藥用成分 相同、藥效穩定的優質種苗。
[0032] 本發明的技術優勢在于：
[0033] 1、本發明利用TTC染色花藥活力和聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性，建立了總 狀花序內每一朵小花從花苞展開到花朵凋謝的整個花期的花藥和柱頭的發育時間表，這樣 我們可以根據柱頭和花藥的發育成熟度，挑選活力強的花藥和可授性好的柱頭進行授粉組 合的配比，大大提高了授粉后蒴果的座果率，有效解決了實際生產中授粉量大而座果率低 的生廣瓶頸。
[0034] 2、本發明提出了在同一個總狀花序內進行授粉制種，這樣可以有效保障親本材料 的遺傳背景一致，得到大量的蒴果遺傳背景一致，有效解決種源的遺傳穩定性問題，將有助 于提供遺傳背景一致、藥用成分相同、藥效穩定的優質種苗。
[0035] 本發明使用的TTC染色法測定鐵皮石斛花藥的活力，有如下優點：1)TTC染色直接 取材于新鮮組織，方便易行;2)染色的全過程約15~30min，節省時間；3)染色過程中不需要 特殊的實驗器材，所需儀器設備簡單;4)在3天時間內，10mL的TTC染液可重復使用2-3次，大 約能染18張切片。
[0036] 本發明采用TTC染色法和聯苯胺-過氧化氫法測定遺傳背景一致的鐵皮石斛的花 藥活力和柱頭可授性，揭示花藥和柱頭的不同步發育現象。
【附圖說明】
[0037] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0038]圖1為TTC染色法測定花藥活力，即，TTC染色后的不同花期的花藥示意圖；Id~30d 分別代表開花1 -30天的花藥。
[0039] 圖2為聯苯胺-過氧化氫染色法測定柱頭可授性；即，聯苯胺-過氧化氫染色后的不 同花期的柱頭示意圖；Id~30d分別代表開花1-30天的柱頭。
[0040] 圖3為各授粉組合的座果率；
[0041] 據花藥活力和柱頭可授性把花藥分為3組:開花l-7d(A)，開花8-14d(B)，開花14d 以后(C);柱頭也分為3組:開花l-7d(a)，開花8-21d(b)，開花21d以后(c)。
[0042] Aa代表:開花l_7d(A)的花藥與開花l_7d(a)的柱頭進行組合授粉；
[0043] Ab代表:開花l_7d(A)的花藥與開花8_21d(b)的柱頭進行組合授粉；
[0044] Ac代表:開花l_7d(A)的花藥與開花21d以后(c)的柱頭進行組合授粉；
[0045] Ba代表:開花8_14d(B)的花藥與開花l_7d(a)的柱頭進行組合授粉；
[0046] Bb代表:開花8_14d(B)的花藥與開花8_21d(b)的柱頭進行組合授粉；
[0047] Be代表:開花8_14d(B)的花藥與開花21d以后(c)的柱頭進行組合授粉；
[0048] Ca代表:開花14d以后(C)的花藥與開花l_7d(a)的柱頭進行組合授粉；
[0049] Cb代表:開花14d以后(C)的花藥與開花8_21d(b)的柱頭進行組合授粉；
[0050] Cc代表:開花14d以后(C)的花藥與開花21d以后(c)的柱頭進行組合授粉；
[0051]注：0.05。
【具體實施方式】
[0052]實施例1、一種獲得基于花器官發育的鐵皮石斛制種法的方法，依次進行以下步 驟：
[0053] 1)、在初現花苞的枝條的基部掛上標簽(即，作標記）；
[0054] 將掛牌的2個枝條分別進行如下操作，即，其中一個枝條進行下述步驟2)，同時，另 一個枝條進行下述步驟3);
[0055] 2)、該枝條每天拍照跟蹤或者圖示文字記錄整個總狀花序內每一朵小花從花苞形 成開始到花朵凋謝結束時的整個花期的變化，并在標簽上注明開花日期；
[0056] 3)、該枝條摘取同一總狀花序內，整個花期不同開花天數的小花;小心取出鐵皮石 斛小花藥帽里的2塊花粉塊，置于離心管內，加0.3ml TTC染液沒過花藥，37°C避光水浴鍋孵 育15min后，棄染液，用無菌水漂洗花藥，吸水紙吸干表面水分;將染色后的花藥置于體視變 焦顯微鏡下觀察拍照；
[0057] TTC染液的具體制備方法如下：
[0058] 稱取0.5g的TTC粉末，用O.lmol/L pH 7.5的磷酸緩沖液085)溶解并定容至 100ml，配制成濃度為0.5 %的TTC染色液。溶液避光保存，若發紅則不能再用。
[0059] 將上述已取出花藥的小花，用解剖刀緊貼隔膜下沿切開合蕊柱，切掉雄蕊露出柱 頭窩；將柱頭窩置于載玻片上，滴加2~3滴(約0. lml)滴聯苯胺-過氧化氫反應液于柱頭窩 上;迅速將載玻片置于體視變焦顯微鏡下觀察拍照；
[0060] 聯苯胺-過氧化氫反應液的制備方法具體如下：1 %聯苯胺溶液、3%過氧化氫溶 液、蒸餾水按照體積比4:11:22配制。
[0061] 在同一總狀花序內，選擇花藥活力最強的花藥授粉到可授性最強的柱頭。花藥經 TTC染色，花藥染成紅色越深表明活力越強，而不著色的花藥不具活力;聯苯胺-過氧化氫染 色柱頭，柱頭四周的反應液呈現藍色越深、氣泡量越多表明柱頭的可授性越強;反之越差。 根據染色結果，建立花藥和柱頭的發育時間表，取花藥活力最強的花藥授粉到可授性最強 的柱頭上。
[0062] 備注說明，花藥的發育時間表中對應內容為:不同開花天數的花藥，經TTC染色后 紅色深淺度的變化，代表整個花期中花藥活力的變化;柱頭的發育時間表中對應內容為:不 同開花天數的柱頭，經聯苯胺過氧化氫染色后的藍色深淺度和氣泡量的變化，代表整個花 期中柱頭的可授性的變化。
[0063] 所得結果具體如下:根據染色結果，建立花藥和柱頭的發育時間表。根據花藥活力 和柱頭可授性把花藥分為3組:開花l-7d(A)，開花8-14d(B)，開花14d以后(C);柱頭也分為3 組:開花l_7d(a)，開花8-21d(b)，開花21d以后(c)。
[0064] 經觀察：上述3組花藥中，開花第8~14d的花藥紅色最深，即，該組花藥的活力最 強。上述3組柱頭中，開花第8~21d的柱頭四周的反應液呈現的藍色最深、氣泡量最多，即， 該組柱頭的可授性越強。
[0065]實驗1、取開花第10d的花藥授粉到開花第15d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝 條做5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合的座果率為96.67%，如 圖3所述。
[0066] 依照上述方法，150天左右，可獲得遺傳背景一致、高坐果率的蒴果。
[0067]備注說明：取開花第8~14d任一天的花藥授粉到開花第8-21d任一天的的柱頭上， 重復上述實驗1，座果率均為約96~97%。
[0068]對比例1、取開花4d的花藥授粉到開花4d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條做5 朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Aa)的座果率為1.67%，如圖3 所述。
[0069]對比例2、取開花4d的花藥授粉到開花15d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條做 5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Ab)的座果率為5.42%，如圖 3所述。
[0070]對比例3、取開花4d的花藥授粉到開花25d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條做 5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Ac)的座果率為1.67%，如圖 3所述。
[0071]對比例4、取開花10d的花藥授粉到開花4d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條做 5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Ba)的座果率為2.92%，如圖 3所述。
[0072]對比例5、取開花10d的花藥授粉到開花25d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條 做5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Be)的座果率為1.25%，如 圖3所述。
[0073]對比例6、取開花20d的花藥授粉到開花4d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條做 5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Ca)的座果率為2.08%，如圖 3所述。
[0074]對比例7、取開花20d的花藥授粉到開花15d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條 做5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Cb)的座果率為2.92%，如 圖3所述。
[0075]對比例8、取開花20d的花藥授粉到開花25d的柱頭上。授粉16個枝條，每一個枝條 做5朵花的授粉，共計授粉80朵，重復3次。結果發現，該授粉組合(Cc)的座果率為2.92 %，如 圖3所述。
[0076] 由圖3可知，開花8-14d的花藥和開花8-21d的柱頭組合的授粉組合(Bb)，座果率達 到96.67%左右，顯著高于其他組合，實驗表明要獲得高座果率，強活力的花藥和強可授性 的柱頭缺一不可。
[0077] 上述案例的對比結果具體如下表1所示：
[0078] 表 1
[0080]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 基于花器官發育的鐵皮石斛制種法，其特征是： 取開花第8~14d的花藥授粉到開花第8~21d的柱頭上。2. 獲得如權利要求1所述的鐵皮石斛制種法的方法，其特征是包括如下步驟： 1 )、待鐵皮石斛枝條初現花苞時，掛牌； 2) 、摘取同一總狀花序內整個花期不同開花天數的小花； 3) 、采用TTC染色法測定整個花期不同開花天數的小花花藥的活力； 4) 、采用聯苯胺-過氧化氫法測定整個花期不同開花天數的小花柱頭的可授性； 5) 、在同一總狀花序內，選擇花藥活力強的花藥授粉到可授性強的柱頭。3. 根據權利要求2所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是： 在步驟1)之后， 選取一個枝條上的總狀花序進行如下操作：記載該總狀花序內，每一朵小花從花苞形 成開始到花朵凋謝結束時的整個花期； 同時，選取另一個枝條上的總狀花序進行上述步驟2)~步驟5)。4. 根據權利要求2或3所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是： 所述步驟3)中的TTC染色法測定為：取出鐵皮石斛小花藥帽里的花藥，置于離心管內， 加TTC染液沒過花藥，37 °C避光孵育15~30min后，棄染液，用無菌水漂洗花藥，吸水紙吸干 表面水分;將染色后的花藥置于體視變焦顯微鏡下觀察拍照；花藥染成紅色越深表明活力 越強。5. 根據權利要求4所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是： 所述!'1'(：染液的制備方法為:將0.58的1'1'(：用0.1111〇1/1口!17.5的磷酸緩沖液溶解并定 容至100ml，從而配制成濃度為0.5%的TTC染色液。6. 根據權利要求2或3所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是： 所述步驟4)的聯苯胺-過氧化氫法測定為:將小花朵連花柄采下，去掉所有花瓣；用解 剖刀沿隔膜切開合蕊柱，去掉雄蕊露出柱頭窩；將柱頭窩置于載玻片上，滴加2~3滴聯苯 胺-過氧化氫反應液于柱頭窩上;將載玻片迅速置于體視變焦顯微鏡下觀察拍照;柱頭四周 的反應液呈現藍色越深、氣泡量越多表明柱頭的可授性越強。7. 根據權利要求6所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是： 聯苯胺-過氧化氫反應液的制備方法為:將質量濃度為1 %聯苯胺溶液、體積濃度為3% 過氧化氫溶液、蒸餾水按照4:11:22的體積比配制而得。8. 根據權利要求2或3所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是:所述步驟5)中，每 個總狀花序授粉3~5朵花。9. 根據權利要求2或3所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是:所述步驟1)的掛 牌為:在初現花苞的枝條基部掛上標簽。10. 根據權利要求2或3所述的獲得鐵皮石斛制種法的方法，其特征是:將掛牌的枝條， 每天拍照跟蹤或者圖示文字記錄整個總狀花序內每一朵小花從花苞形成開始到花朵凋謝 結束時的整個花期。
【文檔編號】A01H1/02GK105850714SQ201610221260
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月11日
【發明人】毛碧增, 張亞惠, 婁沂春
【申請人】浙江大學