一種蘿卜細胞核雄性不育系及其選育方法

一種蘿卜細胞核雄性不育系及其選育方法
【專利摘要】本發明涉及作物育種技術領域，特別公開了一種蘿卜細胞核雄性不育系及其選育方法。該蘿卜細胞核雄性不育系，其特征在于：所述不育系是由一對隱性核基因控制的雄性不育系，其育性遺傳穩定，不受環境等因素的影響，雌蕊發育正常，雄蕊完全退化，無有效花粉，其保藏號為P201411，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，保藏日期為2014年10月26日，分類命名為136S。本發明打破了傳統蘿卜雄性不育僅有細胞質不育類型的局限，為蘿卜利用雄性不育育種開辟了新的途徑，同時該不育材料的發現對于解決蘿卜雄性不育材料基因單一具有十分重要的意義。CCTCC No:P20141120141026
【專利說明】一種蘿卜細胞核雄性不育系及其選育方法
[0001] ( - )技術領域 本發明涉及作物育種技術領域，特別涉及一種蘿卜細胞核雄性不育系及其選育方法。
[0002] (二)【背景技術】 雄性不育在高等動植物中普遍存在，據統計，人們至少在617個種和種間雜交種中發現 了雄性不育現象，它分布在43個科的162個屬的植物中，幾乎涵蓋了所有的栽培作物。
[0003] 十字花科植物大多為異花受粉作物，存在著明顯的雜種優勢，但由于它們的花器 較小，人工去雄操作費時費力，且一次授粉獲得的雜交種子很少，為解決這一問題，育種工 作者選用自交不親和系育種，但自交不親和系易受環境等因素的影響，親和性不穩定，經常 出現制種純度不高的現象。利用植物雄性不育系進行雜交制種，較好地解決了自交不親和 系制種的問題，并可提高雜交種子的純度，增加農作物的產量，己成為國際種業的主要發展 方向。蘿卜雄性不育系育種是開展研究較早，并且進行商業化應用較為成熟的一項技術。 [0004]目前在生產上使用的蘿卜雄性不育系，通常是由細胞質基因和細胞核基因共同互 作，形成的一種雄性不育現象，蘿卜的不育細胞質一般有0gura-CMS(orfl38)、K 〇s-CMS (orf 125)、DCGMS-CMS和NWB-CMS等類型，但最常見的還是Ogura不育類型；由線粒體基因 orfl38和細胞核中的兩對隱性基因控制，不育系基因型為Smslmslms2ms2，保持系基因型為 Nmslmslms2ms2，（S為不育型細胞質，N為正常細胞質）。蘿卜雄性不育表現為花藥退化，或不能形 成具有正常功能的花粉，而雌蕊發育正常。保持系則具有正常的雄性和雌性器官，自交能正 常結實，當與不育系雜交時，能夠保持不育系的不育性。
[0005] 蘿卜細胞質雄性不育基因存在于線粒體DNA上，主要是由于線粒體基因組分子內或 分子間頻繁重組所形成的異常嵌合基因造成的，目前研究認為，Ogura不育類型雄性不育的 主控基因為〇rfl38, orfl38與線粒體基因組中具有正常功能的基因共轉錄，產生異常轉錄 本和翻譯產物，從而在花藥發育的某個時期干擾線粒體的正常功能發揮，最終導致雄性不 育現象的發生。線粒體基因組的轉錄和翻譯產物盡管只占整個細胞基因組產物的很少部 分，但其轉錄和翻譯情況比較復雜。當用恢復系與不育系進行雜交時，恢復系中的恢復基因 能夠產生一種PPR蛋白，該蛋白抑制〇rfl38的表達，從而達到育性恢復的目的。
[0006] 到目前為止所知的蘿卜雄性不育類型中，Ogura雄性不育是導入率和穩定性方面最 優秀的不育材料，同時Ogura雄性不育也是目前研究最為深入的一種雄性不育材料，日本學 者Yamagishi通過對野生種、栽培種等不育材料進行測序，將Ogura雄性不育基因 orf!38分 為九個類型(如下表）。據有關資料研究，A型與F型具有相同的恢復和保持關系，盡管有的堿 基變異導致了氨基酸發生了變化，但目前通過試驗驗證，能夠明確導致雄性不育的有A、B、 D、F、H型，其它類型還有待驗證。
[0007] 注:表中Aa欄的"+"為基因中缺失39個堿基對;0rfl38類型中A為最早發現的測序 的序列;其它欄中為與A型沒有變化。
[0008] 在日本發現Ogura后，我國從上世紀70年代初先后發現蘿卜雄性不育株，開始了蘿卜 雄性不育系的育種工作，到80年代中期已先后育出了多個品種在生產上推廣，如山東的魯 蘿卜三號、遼寧的紅豐一號、山西的國光、豐光、河南的鄭研等品種。
[0009] 隨著生物技術的不斷發展，科技工作者將蘿卜Ogura雄性不育基因先后引入到油 菜、甘藍、大白菜、花椰菜等多種十字花科作物上。我國目前發現和使用的蘿卜雄性不育系同 樣為Ogura細胞質雄性不育，目前全世界范圍內使用的蘿卜雄性不育系幾乎全部為Ogura細 胞質類型，隨著雄性不育材料使用的越來越普及，蘿卜及其它十字花科作物的細胞質類型將 嚴重單一化。
[0010] 在十字花科中，細胞核雄性不育現象相對于細胞質雄性不育要少，目前僅在大白 菜、甘藍、油菜、小白菜等作物的自然群體中發現了顯性或隱性核雄性不育材料。如南京農 業大學上世紀80年代在小白菜中發現細胞核雄性不育材料，并利用"兩用系"進行雜交制 種;福建省農科院在當地菜心品種"七葉心"中發現核雄性不育材料，并獲得了雄性不育兩 用系;沈陽農業大學在小青口、二青幫大白菜品種中獲得了隱性核基因雄性不育材料;沈陽 市農科所在"萬泉青幫"地方大白菜品種中發現了顯性核基因雄性不育材料，并提出了"顯 性核基因雄性不育與顯性上位基因互作"雄性不育遺傳模式，最終獲得了具有100%不育率 的大白菜雄性不育系；中國農科院在甘藍的自然群體中發現了顯性核基因控制的雄性不育 材料。在蘿卜的研究中，國內還沒有在自然群體中發現由核基因控制的雄性不育材料的報 道。
[0011](三)
【發明內容】
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種拓寬利用范圍、避免細胞質單一問題的 蘿卜細胞核雄性不育系及其選育方法。
[0012]本發明是通過如下技術方案實現的： 一種蘿卜細胞核雄性不育系，其特征在于:所述不育系是由一對隱性核基因控制的雄性 不育系，其育性遺傳穩定，不受環境等因素的影響，雌蕊發育正常，雄蕊完全退化，無有效花 粉，其保藏號為CCTCC No:P201411，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武 漢大學，保藏日期為2014年10月26日，分類命名為蘿卜雄性不育系136S Raphanus sativus L · 〇
[0013]本發明所述的蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法，包括如下步驟： (1) 以雄性不育株為母本，以同一自然群體中的可育株為父本進行測交，同時該父本自 交； (2) 對測交和自交所得的種子進行春化處理，通過春化后的種子播種于隔離網室中，待 開花后，對雜交后代的雄性不育情況進行觀察統計； (3) 以測交后代的不育株為母本，可育株為父本進行雜交；同時以具有正常細胞質的可 育株為母本，以測交后代中的可育株為父本進行雜交； (4) 將雜交收獲的種子經過春化處理后播種于隔離網室中，開花后進行育性調查，確定 種子中的不育株為細胞核控制的雄性不育系； (5) 通過轉錄組測序，找到了雄性不育系所獨有基因轉錄組，并設計引物用cDNA進行 PCR驗證，獲得了雄性不育系獨有的4個mRNA。
[0014]本發明的更優技術方案為： 步驟（1)中，在地方品種自然群體中發現雄性不育株，用Ogura特異引物:0RF-F 5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3 '，和0RF-R 5 ' -GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對不育材料葉片 DNA進行PCR分子標記，沒有出現特異條帶的，說明該不育材料不含有Ogura雄性不育基因， 不屬于通常使用的Ogura細胞質雄性不育類型。
[0015] 步驟(2)中，對測交和自交所得的種子每份取50粒，用35°C的溫水浸泡3小時，然后 放入紙基培養皿中，待種子萌動后，放入2-4°C的冰箱中進行春化處理25天，通過春化后的 種子播種于隔離網室中。
[0016] 在進行蘿卜細胞質雄性不育的研究中，我們在山東的一個地方品種中發現了一株 雄性不育單株，以雄性不育株為母本，以本品種的其它可育株為父本進行雜交，在20個雜交 組合的后代中，有一個組合的后代中出現了50%可育與50%不育株的表現型，繼續以該組合 的父本自交后代與不育株雜交，在雜交后代中，有的組合育性完全恢復，有的組合仍然出現 可育株與不育株各50%的現象，并且在父本的自交后代中出現了育性的分離現象，可育株與 不育的比例為3:1;同時在不育株與保持材料的雜交后代中，可育株的自交后代同樣出現了 育性的分離，可育株與不育株的比例同樣為3:1，我初步確定該不育材料為細胞核控制的雄 性不育。
[0017]雄性不育基因的確定與定位方法包括如下步驟： (1)線粒體與葉綠體全測序 為了尋找該不育材料的不育基因，我們對該不育材料和一個Ogura細胞質雄性不育類 型的保持系進行了線粒體與葉綠體全測序。為保證樣品純度，防止出混雜現象，在提取線粒 體和葉綠體DNA過程中，我們分別從一個單株提取樣品，根據線粒體和葉綠體DNA的提取方 法，提取了含有線粒體和葉綠體的混合DNA樣品，進行高通量DNA測序，測序深度在1000倍以 上，經過De novo程序組裝及PCR查補間隙，完成了線粒體和葉綠體的測序組裝工作（兩個 DNA序列還未發表），通過本地B1 ast，兩者的線粒體DNA完全一致，葉綠體DNA新型不育系僅 比對照品種在其鏡像重復區內多出了 31個堿基的重復，其它完全一致，對發生變異的區域 進行基因和開放閱讀框(ORF)比對、尋找，該區域不在已明確的葉綠體基因內，也未發現有 大于150bp的ORF存在。
[0018] (2)生物遺傳學試驗驗證。
[0019] 試驗一：以對照品種為母本，以不育系和保持系的雜交后代中可育株為父本進行 雜交，獲得F1;取20料F1代的種子進行萌動、春化處理，開花后，每個F1代單株進行自交，獲 得F2代種子;每株F1代取50粒自交的F2代種子，同樣進行萌動、春化處理，觀察其育性分離 情況。
[0020] 表1 F2代育性分離情況
在20株F2代中，有11株為全部可育，9株出現育性分離，合計可育株330株，不育株108 株，基本符合核隱性基因的遺傳規律。
[0021] 試驗二:在該不育材料保持系的選育中，凡是能夠給不育系保持的單株，其保持能 力都是50%。對具有保持能力的單株自交，在其85株自交后代中，有64株為可育株，21株不育 株，約為3:1，符合孟德爾單基因隱性基因控制性狀的遺傳規律;我們又以23個可育株中的 15株分別與不育株雜交，種子成熟后，經春化處理，15個組合中，有5個組合的后代育性完全 恢復，有10個組合的后代仍然出現各50%的不育株和可育株。
[0022] 我們以"M"代表育性基因的顯性性狀，以"m"代表育性基因的隱性性狀，通過以上 的試驗可以斷定，該雄性不育為隱性基因性狀，其基因型為雄性可育的基因型為"MM" 或"Mm"，其中"Mm"型為保持系。當"MM"型可育株與不育系(mm)雜交時，后代基因型為"Mm"， 全部可育；當"Mm"型可育株與不育系(mm)雜交時，后代基因型為"Mm"和"mm"，有50%的可育 株，50%的不育株。
[0023] 3)取該材料的雄性不育系與保持系的花蕾進行轉錄組測序，獲得了多條雄性不育 系所獨有的轉錄，并根據測序組裝得到的基因轉錄組設計PCR引物，將RNA轉化cDNA進行PCR 驗證，最終獲得了4個雄性不育系所獨有的基因轉錄組11]11861161、1]111861162、1]111861163、 Unigene4〇
[0024] 本發明具有以下優點： (1) 蘿卜細胞核雄性不育系的發現，拓寬了蘿卜雄性不育系的利用范圍，原有的Ogura細 胞質類型不育系，是由細胞質基因和兩對核基因共同作用的結果，在保持系的選育上難度 很大，有的材料根本就選不出保持系。蘿卜核雄性不育系是由一對隱性基因控制，在進行保 持系的轉育和選育上相對容易很多，對一些不能利用細胞質不育系的材料提供了新的育種 途徑； (2) 本發明涉及的核隱性雄性不育，避免了 Ogura細胞質雄性不育造成的十字花科作物 細胞質單一問題； (3) 本發明涉及的核雄性不育系是蘿卜中的首次發現，具有雄性不育株花藥退化徹底， 雌蕊發育正常的特點，能夠進行雜交種的配制與選育。
[0025] 本發明打破了傳統蘿卜雄性不育僅有細胞質不育類型的局限，為蘿卜利用雄性不育 育種開辟了新的途徑，同時該不育材料的發現對于解決蘿卜雄性不育材料基因單一具有十 分重要的意義。
[0026](四）【附圖說明】 下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0027]圖1為本發明136S線粒體基因組圖； 圖2為本發明136S葉綠體基因組圖； 圖3為本發明136S與45B葉綠體基因組DNA的差別比較圖； 圖4為本發明蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法步驟圖； 圖5為本發明136S與136F的基因差異表達圖。
[0028](五)【具體實施方式】 一種蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法，包括如下步驟： (1)在地方品種136自然群體中發現雄性不育株（136S)，用Ogura特異引物:0RF-F 5 ' -TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3 '，和0RF-R 5 ' -GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對不育材料葉片 DNA進行PCR分子標記，沒有出現特異條帶的，說明該不育材料不含有Ogura雄性不育基因。 [0029] (2)對136S和對照品種45B進行線粒體和葉綠體測序 45B是Ogura細胞質雄性不育系的保持系，一般被認為具有正常的細胞質。對136S和對 照品種45B的葉片提取葉綠體和線粒體，為保證樣品純度，防止出混雜現象，在提取線粒體 和葉綠體DNA過程中，分別從一個單株提取樣品，根據線粒體和葉綠體DNA的提取方法，提取 了含有線粒體和葉綠體的混合DNA樣品，進行高通量DNA測序，葉綠體測序深度在600倍以 上，線粒體測序深度在100倍以上，根據測序深度的不同，經過De novo程序組裝及PCR查補 間隙，先組裝葉綠體；組裝完成葉綠體后再用相同的方法組裝線粒體，對De novo組裝的 Contig先與葉綠體DNA序列進行比對，剔除葉綠體DNA部分，再進行線粒體組裝，組裝拼接方 法與葉綠體相同，最后再用PCR的方法，將葉綠體與線粒體相同的DNA序列進行甄別。完成線 粒體和葉綠體的測序組裝工作(兩個DNA序列還未發表)后，通過本地Blast，兩者的線粒體 DNA完全一致，葉綠體DNA新型不育系僅比對照品種在其鏡像重復區內多出了31個堿基的重 復，其它完全一致，對發生變異的區域進行基因和開放閱讀框(0RF)比對、尋找，該區域不在 已明確的葉綠體基因內，也未發現有大于150bp的0RF存在。由此說明，136S不育材料在細胞 質上與正常可育株沒有明顯的區別（136S線粒體基因組圖見圖1，葉綠體圖基因組見圖2,葉 綠體突變區域見圖3,圖3中注:使用Vector NTI軟件對136S雄性不育葉綠體與正常可育株 45B葉綠體進行比對，在基因組的鏡像重復區，136S多出了 31個堿基）。
[0030] (3)136S不育系和保持系的選育如圖4。
[0031] 2012年春在紗網隔離條件下，以雄性不育材料136S作母本，以同一自然群體中的 可育株作父本進行測交，做測交組合31個，同時與五不同品種進行測交，測交組合147個，每 個測交組合的有效結籽粒數都在50粒以上;測交父本自交的有效結籽數也在50粒以上。 [0032] 2012年秋，7月初，對測交和自交所得的種子每份取50粒，用35 °C的溫水浸泡3小 時，然后放入紙基培養皿中，待種子萌動后，放入2-4 °C的冰箱中進行春化處理25天，通過春 化后的種子播種于隔離網室中，待開花后，對測交后代的雄性不育情況進行觀察統計。雄性 不育株的標準為，雌蕊發育正常，雄蕊完全退化或不能形成有效花粉。
[0033]在測交一代中出現具有部分保持能力的單株2株，其保持能力都在50%左右;這兩 株都是出現在136的自然群體中的可育株，其它品種的測交后代全部為可育株，沒有選出具 有保持能力的單株。2株具有保持能力的單株，在自交后代中也出現了育性的分離，一株為 不育株12,可育株37;另一株為不育株11，可育株36。
[0034]以測交后代的不育株為母本，可育株為父本進行雜交(FA2)。以具有正常細胞質的 可育株45B為母本，以測交后代中的可育株為父本進行雜交(FBI)。
[0035] 2013年春將2012年秋收獲的種子經過春化處理后播種于網室中，開花后進行育性 調查，以測交后代的不育株為母本與可育株雜交后代FA2中，出可育株和不育株各50%;以具 有正常細胞質的可育株45B與測交后代中的可育株進行雜交，其后代FBI中全部為可育。 [0036]以FA2后代中的不育株為母本，可育株為父本雜交(FA3) ;FB1進行自交(FB2)。
[0037] 2013年秋對春季收獲的FA3和FB2代種子進行春化處理，通過春化后種植于網室 中，開花后調查育性，FA3后代中可育株和不育株各占50%;對于新型不育材料連續選育了5 代，形成了穩定的不育系（136S)和保持系（136F)。
[0038] 在FB2代中有11個FBI的后代為全部可育，9個FBI的后代出現了育性的分離，出現 育性分離的FB2代，共有330個可育株，108個不育株，約為3:1。
[0039]此試驗結束后，已基本明確該不育材料為核基因控制的隱性單基因雄性不育，以 其測交后代中的不育株為不育系（136S)，可育株為保持系，選育出了穩定的具有50%保持能 力的保持系。136S不育系的育性退化徹底，經過多代觀察，其育性不受環境等因素的影響， 花藥完全退化，不能形成具有功能的花粉，雌蕊發育正常。不育株的花器略小于可育株。 [0040] (4)136S特異cDNA引物的篩選 取136S與其保持系兩個材料的花蕾進行RNA測序。取樣時取整枝花序未開放的全部花 蕾，每個重復取一個單株，每個材料3個重復。測序工作由測序公司完成。提取樣品總RNA后， 用帶有〇1 igo(dT)的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以 mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然后再合成第二條cDNA鏈，經過純化、 洗脫后，做末端修復、加 P〇ly(A)并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選 擇，最后進行PCR擴增，建好的測序文庫（200bp)用11 lumina HiSeq 2000進行測序，以組裝 完成的Unigene進彳丁基因的差異表達分析。
[0041 ] 在11萬個Unigene中，差異表達的基因 3391個(見圖5)136S與136F(保持系）比較， 調高表達的基因 745,調低表達的2645個。在745個調高表達的基因中，136S所獨有的有11個 基因，以這11個基因的mRNA序列設計引物，將136S與136F的RNA轉化為cDNA，用設計的特異 引物進行PCR擴增驗證，最后篩選得到4個136S所獨有的mRNA。分別是：
[0042]用所篩選的 4 個特異引物1111186116 1-口1'；!_11161'，1]11186116 2-口1'；!_11161'，1]11186116 3-primer，Unigene 4-primer對雄性不育系136S的cDNA進行PCR擴增，有特異條帶出現的即為 不育系，否則為保持系或其它材料。
【主權項】
1. 一種蘿卜細胞核雄性不育系，其特征在于:所述不育系是由一對隱性核基因控制的雄 性不育系，其育性遺傳穩定，不受環境等因素的影響，雌蕊發育正常，雄蕊完全退化，無有效 花粉，其保藏號為P201411，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學， 保藏日期為2014年10月26日，分類命名為136S。2. 根據權利要求1所述的蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法，其特征為，包括如下步驟： (1) 以雄性不育株為母本，以同一自然群體中的可育株為父本進行測交，同時該父本自交； (2) 對測交和自交所得的種子進行春化處理，通過春化后的種子播種于隔離網室中，待開花 后，對雜交后代的雄性不育情況進行觀察統計；（3)以測交后代的不育株為母本，可育株為 父本進行雜交，同時以具有正常細胞質的可育株為母本，以測交后代中的可育株為父本進 行雜交；（4)將雜交收獲的種子經過春化處理后播種于隔離網室中，開花后進行育性調查， 確定種子中的不育株為細胞核控制的雄性不育系；（5)通過轉錄組測序，找到了雄性不育系 所獨有基因轉錄組，并設計引物用cDNA進行PCR驗證，獲得了雄性不育系獨有的4個mRNA。3. 根據權利要求2所述的蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法，其特征在于：步驟（1)中， 在地方品種自然群體中發現雄性不育株，用Ogura特異引物：ORF-F 5 ' -TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3 '，和0RF-R 5 ' -GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對不育材料葉片 DNA進行PCR分子標記，沒有出現特異條帶的，說明該不育材料不含有Ogura雄性不育基因。4. 根據權利要求2所述的蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法，其特征在于：步驟(2)中， 對測交和自交所得的種子每份取50粒，用35°C的溫水浸泡3小時，然后放入紙基培養皿中， 待種子萌動后，放入2_4°C的冰箱中進行春化處理25天，通過春化后的種子播種于隔離網室 中。5. 根據權利要求2所述的蘿卜細胞核雄性不育系的選育方法，其特征在于：步驟(5)中， 弓 I物為四個，分另IJ為 Unigene 1-primer ： F : TCATCCTCTCGGGATGAAAC，R : CGTCGACCCTTCTCTCTACG；Uni gene 2-primer：F: CGTAACAGCGCAAACGTAAA，R: TCCAAAATGGCATCATTCAA；Uni gene 3-primer：F: CTGAGCATACGTGGGTGCTA，R: TAGAAGCGCATGATGACGAG；Uni gene 4-primer：F:TCTGGCTGAACCCACTCTCT,R: CCTCTGAAATCCCTCCCTTC;對不育材料花蕾中cDNA進行PCR分子標記，沒有出現特異條帶的為 可育株，出現特異條帶的為不育系。
【文檔編號】A01H5/00GK105830907SQ201610110369
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年2月29日
【發明人】王效睦, 白靜, 王俊峰, 段乃彬, 謝坤
【申請人】山東省農作物種質資源中心