一種黃精離體根莖的高效誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種中藥材組織培養方法，尤其涉及一種黃精離體根莖的高效誘導方法。
【背景技術】
[0002]黃精是百合科多年生草本植物黃精(Polygonatum sibiricumRed)、滇黃精(P.kingianum C oil.eHtemsl.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的根莖，具有潤肺滋陰，補中益氣，益腎填精的作用。近代研究表明，黃精含有煙酸、醒類、豁液質、淀粉、二氨基丁酸、黃精多糖及低聚糖等成分，有麻醉及降低動物血壓的作用，對腎上腺素引起的血糖過高有抑制作用，對防止動脈粥樣硬化及肝臟脂肪浸潤、對改善腎臟功能也有較好功效。黃精還是一味抗菌良藥，對傷寒桿菌、結核桿菌、金黃色葡萄球菌及皮膚癬菌等均有一定抑制作用。近年來，本品已廣泛應用于冠心病、高血壓、糖尿病、肺結核、再生障礙性貧血，以及預防放療、化療引起的副作用等，取得了較好的療效。隨著市場需求量不斷增加和野生資源不斷減少，黃精人工栽培已成為市場供求之主體。黃精繁殖方式主要是有性繁殖(種子)和無性繁殖(根莖)兩種方式。由于黃精種子難收集，種子發芽率低，而且種子繁殖，育苗時間又長，這樣就大大增加了黃精的栽培成本，不利于黃精的人工大面積種植。所以在當前的人工栽培中，繁殖主要依靠根莖的無性繁殖，但該方法繁殖系數低，種根莖用量大，既不經濟，又限制了黃精的產量潛力，不便栽植管理推廣。因此，黃精種苗問題成了人工大面積種植的瓶頸。而現有黃精栽培基地的黃精品種也迫切需要對其進行提純復壯，以培育高產抗病脫毒的種苗。
【發明內容】
[0003]為了解決根莖高效誘導方法上述技術問題，本發明采用了一種黃精離體高效誘導方法，解決了現有技術中黃精組培生產過程繁瑣復雜的程序，不適合大規模生產的問題，既保證不定芽的誘導率，又促使離體根莖的高效誘導，最終解決黃精資源保護和市場需求矛盾的問題。
[0004]—種黃精離體根莖的高效誘導方法，主要包括以下步驟:
[0005](I)外植體的選擇:
[0006]選擇黃精帶芽根莖、嫩葉或葉柄作為外植體；
[0007](2)不定芽的誘導培養:
[0008]不定芽誘導培養基為:MS+6-BA1.0?4.0mg/L+2，4-D 0.I?0.5mg/L+白糖3%+瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0;
[0009]將步驟(I)所得外植體接種在不定芽誘導培養基中，25?27°C、光照1200Lx、12h/d條件下培養35?40天；
[0010](3)不定芽的增殖培養:
[0011]不定芽增殖培養基為:MS+6-BA0.5?2.0mg/L+2，4-D 0.I?0.5mg/L+白糖3%+瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0;
[0012]將步驟(2)所得分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小，接種在不定芽增殖培養基中，25?27°C、光照1200Lx、12h/d條件下培養30?35天；
[0013](4)離體根莖的誘導培養:
[0014]離體根莖誘導培養基:l/2MS+6-BA0.3?I.0mg/L+NAA 0.I?0.5mg/L+白糖3%，pH5.8?6.0;
[0015]將步驟(3)所得不定芽接種于離體根莖誘導培養基中，25?27°C、光照1200Lx、12h/d條件下培養45?50天；
[0016](5)離體根莖的移栽或儲藏:
[0017]將步驟(4)所得離體根莖取出，洗凈粘附的培養基，陰干表面水分，直接進行大田移栽，或儲藏起來。
[0018]所述步驟(I)中的外植體優選帶芽根莖。
[0019]所述步驟(I)中的外植體在切斷之前經過滅菌處理。
[0020]所述步驟(2)、(3)、(4)中的培養基經過濕熱滅菌處理15?30min。
[0021]與現有技術相比較，本發明達到的有益效果為:本發明實現了將外植體誘導發生大量不定芽，并在瓶內能直接將帶不定芽塊莖誘導形成離體根莖，工藝簡單，誘導率高，增殖力強，離體根莖移栽成活率高，不需要生根培養和特殊馴化即可直接移栽大田或儲藏，能在短時間內生產出大量優質黃精種苗，具有較大的生產應用價值。本發明以兩種常用的植物生長調節劑進行不同濃度配比，經過固液培養，實現了高效的不定芽誘導和離體根莖的直接形成，不需要愈傷組織誘導、生根培養和馴化等常規繁瑣處理，就可將離體根莖直接進行大田移栽。
【具體實施方式】
[0022]為了加深對本發明的理解，下面結合實施案例對本發明進一步描述，該實施案例僅用于解釋本發明，并不構成對本發明保護范圍的限定。本領域技術人員在本發明基礎上做出的修改或改進，均應屬于本發明要求保護的范圍。
[0023]本發明實施例所用的試驗材料為貴州貴陽野生黃精。
[0024]實施例1
[0025]取帶芽根莖洗凈，用75%乙醇擦洗表面，再用自來水沖洗干凈，75 %乙醇浸泡30s，滅菌去離子水涮洗兩次2.5%次氯酸鈉5min滅菌，滅菌去離子水涮洗2次，再用2.5%次氯酸鈉5min滅菌，去離子水涮洗5次，無菌濾紙吸干材料表面水份，將材料切成直徑0.5cm的帶芽塊莖接于不定芽誘導培養基(MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.lmg/L+市售白糖3%+瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養35(1后，90%外植體都分化出不定芽；將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小接于不定芽增培養基(MS+6-BA
0.5mg/L+2,4-D 0.lmg/L+市售白糖3%+瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0。
[0026])，25?27°C，光照1600Lx，光照12h/d條件下培養30d后，將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5011大小接于離體根莖誘導培養基(1/21^+6-84 0.3mg/L+NAA 0.lmg/L+市售白糖3%,pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養50(1后，將粘附再誘導出來的離體根莖洗凈，陰干表面水分，直接移栽大田，在28°C下，1d左右就開始發芽，發芽率達90%以上。
[0027]實施例2
[0028]取帶芽根莖洗凈，用75%乙醇擦洗表面，再用自來水沖洗干凈，75 %乙醇浸泡30s，滅菌去離子水涮洗兩次2.5%次氯酸鈉5min滅菌，滅菌去離子水涮洗2次，再用2.5%次氯酸鈉5min滅菌，去離子水涮洗5次，無菌濾紙吸干材料表面水份，將材料切成直徑0.5cm的帶芽塊莖接于不定芽誘導培養基(MS+6-BA 1.5mg/L+2，4-D 0.2mg/L+市售白糖3 % +瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養35(1后，90%外植體都分化出不定芽；將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小接于不定芽增培養基(MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 0.21^/1+市售白糖3%+瓊脂粉58/1，？!1 5.8?6.0。
[0029])，25?27 V，光照1600Lx，光照12h/d條件下培養30d后，將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5011大小接于離體根莖誘導培養基(1/21^+6-84 0.5mg/L+NAA 0.lmg/L+市售白糖3%,pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養50(1后，將粘附再誘導出來的離體根莖洗凈，陰干表面水分，直接移栽大田，在28°C下，1d左右就開始發芽，發芽率達90%以上。
[0030]實施例3
[0031 ] 取帶芽根莖洗凈，用75%乙醇擦洗表面，再用自來水沖洗干凈，75 %乙醇浸泡30s，滅菌去離子水涮洗兩次2.5%次氯酸鈉5min滅菌，滅菌去離子水涮洗2次，再用2.5%次氯酸鈉5min滅菌，去離子水涮洗5次，無菌濾紙吸干材料表面水份，將材料切成直徑0.5cm的帶芽塊莖接于不定芽誘導培養基(MS+6-BA 2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L+市售白糖3 % +瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養35(1后，90%外植體都分化出不定芽；將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小接于不定芽增培養基(MS+6-BA1.5mg/L+2,4-D 0.21^/1+市售白糖3%+瓊脂粉58/1，？!1 5.8?6.0。
[0032])，25?27 V，光照1600Lx，光照12h/d條件下培養30d后，將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5011大小接于離體根莖誘導培養基(1/21^+6-84 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+市售白糖3%,pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養50(1后，將粘附再誘導出來的離體根莖洗凈，陰干表面水分，直接移栽大田，在28°C下，1d左右就開始發芽，發芽率達90%以上。
[0033]實施例4
[0034]取帶芽根莖洗凈，用75%乙醇擦洗表面，再用自來水沖洗干凈，75 %乙醇浸泡30s，滅菌去離子水涮洗兩次2.5%次氯酸鈉5min滅菌，滅菌去離子水涮洗2次，再用2.5%次氯酸鈉5min滅菌，去離子水涮洗5次，無菌濾紙吸干材料表面水份，將材料切成直徑0.5cm的帶芽塊莖接于不定芽誘導培養基(MS+6-BA 4.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L+市售白糖3 % +瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0)，25?27°(:，光照16001^，光照1211/(1條件下培養35(1后，90%外植體都分化出不定芽；將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小接于不定芽增培養基(MS+6-BA
2.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+市售白糖3 % +瓊脂粉 5g/L，pH 5.8?6.0)，25?27 °C，光照16001^，光照1211/(1條件下培養30(1后，將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.50]1大小接于離體根莖誘導培養基(1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+市售白糖3%，pH 5.8?6.0)，25?27°C，光照1600LX，光照12h/d條件下培養50d后，將粘附再誘導出來的離體根莖洗凈，陰干表面水分，直接移栽大田，在28 °C下，1d左右就開始發芽，發芽率達90 %以上。
【主權項】
1.一種黃精離體根莖的高效誘導方法，其特征在于:主要包括以下步驟: (1)外植體的選擇: 選擇黃精帶芽根莖、嫩葉或葉柄作為外植體； (2)不定芽的誘導培養: 不定芽誘導培養基為:MS+6-BA 1.0?4.0mg/L+2，4-D 0.I?0.5mg/L+白糖3%+瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0; 將步驟(I)所得外植體接種在不定芽誘導培養基中，25?27°C、光照1200Lx、12h/d條件下培養35?40天； (3)不定芽的增殖培養: 不定芽增殖培養基為:MS+6-BA 0.5?2.0mg/L+2，4-D 0.I?0.5mg/L+白糖3%+瓊脂粉5g/L，pH 5.8?6.0; 將步驟(2)所得分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小，接種在不定芽增殖培養基中，25?27°C、光照1200Lx、12h/d條件下培養30?35天； (4)離體根莖的誘導培養: 離體根莖誘導培養基:1/2MS+6-BA 0.3?I.0mg/L+NAA 0.I?0.5mg/L+白糖3% ,pH5.8?6.0; 將步驟(3)所得不定芽接種于離體根莖誘導培養基中，25?27°C、光照1200Lx、12h/d條件下培養45?50天； (5)離體根莖的移栽或儲藏: 將步驟(4)所得離體根莖取出，洗凈粘附的培養基，陰干表面水分，直接進行大田移栽，或儲藏起來。2.根據權利要求1所述的黃精離體根莖的高效誘導方法，其特征在于:所述步驟(I)中的外植體為帶芽根莖。3.根據權利要求1所述的黃精離體根莖的高效誘導方法，其特征在于:所述步驟(I)中的外植體在切斷之前經過滅菌處理。4.根據權利要求1所述的黃精離體根莖的高效誘導方法，其特征在于:所述步驟(2)、(3)、(4)中的培養基經過濕熱滅菌處理15?30min。
【專利摘要】本發明提供了一種黃精離體根莖的高效誘導方法，主要包括以下步驟：(1)選用黃精帶芽根莖、嫩葉或葉柄作為外植體，(2)不定芽的誘導培養，(3)不定芽的增殖培養，(4)離體根莖的誘導培養，(5)離體根莖直接移栽或儲藏。本發明實現了在瓶內能直接誘導成離體根莖，工藝簡單，誘導率高，增殖力強，離體根莖移栽成活率高，不需要生根培養和特殊馴化即可直接移栽大田或儲藏，能在短時間內生產出大量優質黃精種苗。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105580734
【申請號】CN201610024403
【發明人】劉紅美, 梁大勇, 方小波, 石建龍
【申請人】遵義市龍馳生物科技有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年1月14日