一種根為外植體的文冠果組織培養快繁方法及其培養的文冠果不定芽的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及木本植物組培與消毒技術領域，具體為一種根為外植體的文冠果組織培養快繁方法及其培養的文冠果不定芽。
【背景技術】
[0002]文冠果是一種經濟價值高、發展前途廣的木本油科樹種，文冠果種子含油量35-40%、種仁含油率高達60%，是一種中國特有的木本油料植物，有北方油茶之稱;其種子油經轉脂化反應可生產生物柴油，是國家林業局推薦的四種木本生物能源植物之一。文冠果還具有重要的藥用和食用價值，由于花色品種多，作為觀花木本植物，也具有很大的發展前景。但目前由于缺乏對文冠果林保護的投入，致使文冠果的品種資源林在日趨縮小，品種資源嚴重減少。文冠果組織培養是解決其種源不足、發展速度緩慢的一個很好的途徑。通常其種苗以莖、葉、種胚、花藥等做為外植體進行組織培養，但是存在以下問題:以種胚為外植體，母本的優良性狀遺傳不穩定，繁殖后代變異大，以莖、葉、花藥等為外植體試管植株長勢弱、增殖率不高且生根困難。
【發明內容】
[0003]為解決上述技術問題，本發明提供一種根為外植體的文冠果組織培養快繁方法及其培養的文冠果不定芽。
[0004]本發明的技術方案如下:一種根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，該方法包括如下步驟:
[0005]I)不定芽誘導培養基的制備:以WPM培養基為基本培養基，每升WPM培養基中添加0.5mL_2mL的植物組培抗菌劑，0.5mg-2.0mg的6_BA，0.5mg-2.0mg的NAA混合均勾后，即得不定芽誘導培養基；
[0006]2)外植體的選取、滅菌:取一年生文冠果根，清洗干凈后，取側根，即為外植體，將外植體消毒；
[0007]3)外植體的培養:將消毒后的外植體接種到不定芽誘導培養基中，在28-30°C，光照25-30天，進行文冠果不定芽的培養。
[0008]進一步的，所述的不定芽誘導培養基具體為:以WPM培養基為基本培養基，每升WPM培養基中添加2.0mL的植物組培抗菌劑，1.0mg的6-BA，1.0mg的NAA混合均勻后，即得不定芽誘導培養基。
[0009]進一步的，所述步驟2)清洗具體為:取一年生文冠果根，用自來水沖洗，然后在含有洗潔精的水中清洗干凈，再用自來水沖洗3h。
[0010]所述含洗潔精的水，是為了將文冠果根外部的污漬清洗干凈，洗潔精的主要成分為直鏈烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、烯烴磺酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、烷基醇酰胺、烷基糖苷等，本方法對洗潔精的濃度不作限定，可根據文冠果根外部的污漬的多少適當調整。
[0011 ]進一步的，所述步驟2)消毒包括如下步驟:將外植體使用60-80 Vt %酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.05-0.1wt %升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，然后將外植體放入添加了4-5vt %植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌4-12h;更好的，所述的消毒為:將外植體使用75#%酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.1^%升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，然后將外植體放入添加了 4vt %植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌9h。
[0012]本發明同時要求保護按照上述方法得到的文冠果不定芽。
[0013]本發明的有益效果如下:
[0014]1、經本發明提供的消毒方法處理后的文冠果根污染率明顯下降，尤其是真菌的感染率；
[0015]2、經本發明提供的組織培養快繁方法得到的文冠果不定芽生長快且能保持親本的優良性狀；
[0016]3、本發明的文冠果組織培養快繁方法組培過程，操作簡單，且培養周期短。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明的文冠果不定芽生長30天的示意圖；
[0018]圖2為本發明的文冠果不定芽生長31天的示意圖；
[0019]圖3為本發明的文冠果不定芽使用傳統消毒方法感染細菌的示意圖；
[0020]圖4為本發明的文冠果不定芽使用傳統消毒方法感染真菌的示意圖。
【具體實施方式】
[0021]通過以下實施例對本發明做進一步說明，所述原料及試劑若無特殊說明，均市售可得，作為優選，植物組培抗菌劑41009ES25購于上海翊圣生物科技有限公司；文冠果來源于內蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗;WPM培養基與完全MS培養基按照本領域公知的配方制備。
[0022]實施例1
[0023]I)不定芽誘導培養基的制備:以WPM培養基為基本培養基，向IL WPM培養基中添加2mL的植物組培抗菌劑，Img 6-BA和Img NAA，混合均勾后，即得不定芽誘導培養基；
[0024]2)外植體的選取、滅菌:取長勢較好的一年生文冠果根，所述的長勢較好的文冠果根按以下標準選擇:選擇地上部分葉子較嫩的文冠果側根，立即用自來水沖洗，然后在含有5g/L洗潔精的水中清洗干凈，再用自來水沖洗3h;取2-3cm長的側根部分，即為外植體；
[0025]3)外植體的消毒:將外植體使用75vt %酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.1wt %升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，消毒后將外植體放入添加了4vt%植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌9h;
[0026]4)外植體的培養:將消毒后的外植體接種到不定芽誘導培養基中，在28-30°C，光照培養30天即可得到文冠果不定芽。
[0027]實施例2
[0028]I)不定芽誘導培養基的制備:以WPM培養基為基本培養基，向IL WPM培養基中添加0.5mL的植物組培抗菌劑，0.5mg 6-BA和0.5mg NAA，混合均勻后，即得不定芽誘導培養基；
[0029]2)外植體的選取、滅菌:取長勢較好的一年生文冠果根，所述的長勢較好的文冠果根按以下標準選擇:選擇地上部分葉子較嫩的文冠果側根，立即用自來水沖洗，然后在含有10g/L洗潔精的水中清洗干凈，再用自來水沖洗3h;取2-3cm長的側根部分，即為外植體；
[0030]3)外植體的消毒:將外植體使用604%酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.05wt%升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，消毒后將外植體放入添加了5vt%植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌4h;
[0031]4)外植體的培養:將消毒后的外植體接種到不定芽誘導培養基中，在28-30°C，光照培養30天即可得到文冠果不定芽。
[0032]實施例3
[0033]I)不定芽誘導培養基的制備:以WPM培養基為基本培養基，向IL WPM培養基中ImL的植物組培抗菌劑，2mg 6-BA和2mg NAA，混合均勾后，即得不定芽誘導培養基；
[0034]2)外植體的選取、滅菌:取長勢較好的一年生文冠果根，所述的長勢較好的文冠果根按以下標準選擇:選擇地上部分葉子較嫩的文冠果側根，立即用自來水沖洗，然后在含有8g/L洗潔精的水中清洗干凈，再用自來水沖洗3h;取2-3cm長的側根部分，即為外植體；
[0035]3)外植體的消毒:將外植體使用80vt %酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.08wt %升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，消毒后將外植體放入添加了4.5vt%植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌12h;
[0036]4)外植體的培養:將消毒后的外植體接種到不定芽誘導培養基中，在28-30°C，光照培養30天即可得到文冠果不定芽。
[0037]經本發明提供的以根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，克服了根冠果根內部容易滋生細菌帶來的消毒難以及不定芽培養難等問題，得到的不定芽長勢良好，組培過程，操作簡單，能夠保持母本的優良特性;且培養周期短，傳統培養周期35-40天，本發明提供的方法培養周期約為30天。
[0038]經本發明提供的消毒方法相對傳統的消毒方法可使文冠果的染菌率由100%降低到71.6%，真菌的感染率由95.0%下降為13.0%。
[0039]從圖1-2可觀察到文冠果不定芽長勢良好，無感染細菌和真菌;從圖3-4可觀察到文冠果按照傳統消毒方法會感染細菌、真菌，無法繼續培養。
[0040]上面結合附圖1-4對本發明【具體實施方式】作了詳細說明，但是本發明并不限于上述實施方式，在本領域技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本發明構思的前提下作出各種變化。
[0041]上述【具體實施方式】僅用于解釋說明本發明的構思，而非對本發明權利保護的限定，凡利用此構思對本發明進行非實質性的改動，均落入本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 1)不定芽誘導培養基的制備:以WPM培養基為基本培養基，每升WPM培養基中添加0.5mL_2mL的植物組培抗菌劑，0.5mg-2.0mg的6_BA，0.5mg-2.0mg的NAA混合均勾后，即得不定芽誘導培養基； 2)外植體的選取、滅菌:取一年生文冠果根，清洗干凈后，取側根，即為外植體，將外植體消毒； 3)外植體的培養:將消毒后的外植體接種到不定芽誘導培養基中，在28-30°C，光照25-30天，進行文冠果不定芽的培養。2.如權利要求1所述的根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，其特征在于，所述的不定芽誘導培養基具體為:以WPM培養基為基本培養基，每升WPM培養基中添加2.0mL的植物組培抗菌劑，1.0mg的6-BA，1.0mg的NAA混合均勾后，即得不定芽誘導培養基。3.如權利要求1所述的根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，其特征在于，所述步驟2)清洗具體為:取一年生文冠果根，用自來水沖洗，然后在含有洗潔精的水中清洗干凈，再用自來水沖洗3h。4.如權利要求1所述的根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，其特征在于，所述的消毒包括如下步驟:將外植體使用60-80vt %酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.05-0.1wt %升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，然后將外植體放入添加了4-5vt%植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌4-12h。5.如權利要求4所述的根為外植體的文冠果組織培養快繁方法，其特征在于，所述的消毒為:將外植體使用75^%酒精沖洗I分鐘，無菌水沖洗3次，0.1wt%升汞沖洗10分鐘，無菌水沖洗5次，然后將外植體放入添加了 4vt %植物組培抗菌劑的完全MS培養基中，攪拌9h。6.—種根據權利要求1所述的根為外植體的文冠果組織培養快繁方法得到的文冠果不定芽。
【專利摘要】本發明公開一種根為外植體的文冠果組織培養快繁方法及其培養的文冠果不定芽，屬于木本植物組培與消毒技術領域，本方法主要包括不定芽誘導培養基的制備，外植體的選取、滅菌，外植體的培養三個步驟，經本發明提供的快繁方法培養得到的文冠果根污染率明顯下降，尤其是真菌的感染率；經本發明提供的組培方法得到的文冠果不定芽生長快且能保持親本的優良性狀。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105580732
【申請號】CN201510917773
【發明人】金華, 盧影影, 鄒吉祥, 郭鵬, 李琳琳
【申請人】大連民族大學
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2015年12月11日