構建生菜突變體庫的ems誘變濃度篩選的制作方法
【專利說明】
一、技術領域
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[0001]本發明闡明采用EMS誘變構建生菜突變體庫的方法，具體是通過設計不同濃度梯度的EMS溶液和不同時間梯度來鑒定最佳的EMS濃度和處理時間，達到生菜種子存活率50%的目標。
二、【背景技術】
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[0002]生菜是一種重要的世界性蔬菜，種植面積廣，食用人群大，但由于生菜自身的特點，人工雜交授粉具有一定的困難，在很大程度上限制了高品質、高抗逆性、高抗病性等的生菜品種的獲得，也使得生菜的種質資源受到限制。因此尋找一種可以改良生菜品質、抗逆性、抗病性等的方法勢在必行。通過EMS誘變，能夠構建大容量的生菜突變體庫，人們可以根據自己所需的目標性狀，從突變體庫中進行篩選，結合Tilling技術來進行突變基因的篩選及鑒定，從而獲得目標基因，再通過轉基因等技術，便可以對生菜目標性狀進行改良。
[0003]EMS是一種很好的化學誘變劑，屬于烷化劑的一種，通常帶有I個或多個活性烷基，該集團能夠轉移到電子密度高的分子上，使得堿基上不同位置增加烷基，從而改變氫鍵。EMS目前是作物誘變育種中應用最為廣泛、效果最好的一種化學誘變劑，效率高、頻率高、范圍廣。EMS的烷化作用主要是以烷基取代DNA鳥嘌呤N-7位置的H離子，使之成為一個帶正電荷的季銨集團，從而產生兩種遺傳效應:一種為轉換型突變，烷化的鳥嘌呤(G)代替胞嘧啶(C)，與胸腺嘧啶(T)配對；另一種是置換現象，鳥嘌呤的N-7烷基化，糖苷鍵斷裂造成脫嘌呤，在復制過程中，脫嘌呤的DNA分子在原鳥嘌呤位置會出現空位，使之不受互補配對原則限制，A、T、G、C四種堿基都可與之配對，從而發生顛換或轉換。
三、
【發明內容】
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[0004]本發明以生菜種子為材料，設定不同的EMS濃度梯度及時間梯度，組成24個組合，分別進行發芽率的鑒定，由于生菜基因組未知，無法通過基因組大小來確定誘變群體大小，因此為了達到較好的實驗數據，我們進行多次重復試驗。濃度梯度和時間梯度包括:濃度(v/V)0.3%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%及 1.0%，分別處理 6h、8h、10h、12h。分別在不同時段計算不同濃度梯度的發芽率，最終確定EMS濃度為0.5% (v/V)，處理6h為最佳，出芽率為 52%。
[0005]本發明的有益效果是:通過確定最佳EMS誘變的濃度梯度和時間梯度組合，來構建生菜突變體庫，為后期篩選目標性狀奠定基礎。同時，為進一步結合Tilling技術篩選目標性轉突變體和轉基因技術獲得高品質生菜品種提供數據參考依據。
四、【附圖說明】
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[0006]圖1是生菜EMS誘變濃度梯度及時間梯度圖。
[0007]圖2是EMS誘變生菜種子發芽率圖。五、【具體實施方式】:
[0008]本研究主要目的為確定構建生菜突變體庫所需EMS溶液的最適宜濃度和時間。根據已建立的不同蔬菜品種的EMS誘變濃度和實踐，確定EMS濃度和時間的最大值和最小值，并設計梯度。每個處理用100粒種子，重復三次，最終確定最佳濃度和時間梯度。
[0009]1、種子進行預處理；
[0010]2、配制EMS溶液所需的磷酸緩沖液；
[0011]3、根據設定的濃度梯度小心加入EMS溶液；
[0012]4、將種子浸泡于EMS溶液中，放在搖床上，室溫，不斷震蕩；
[0013]5、配制IM的NaOH溶液，將接觸過EMS溶液的全部容器浸泡于NaOH溶液中；處理過種子的EMS溶液同樣倒入NaOH溶液中，進行去毒性處理，倒掉處理液；
[0014]6、在不同的時間梯度，計算各濃度的種子出芽率，確定最佳EMS濃度和時間。
[0015]實施例:
[0016]構建生菜突變體庫的EMS誘變濃度篩選
[0017]I材料與方法
[0018]1.1 材料
[0019]由上海市農科院設施園藝所提供優質生菜種子。
[0020]1.2研究方法
[0021]1.2.1生菜種子預處理
[0022]將生菜種子放入水中浸泡3_5h，使種皮軟化，便于后期處理。
[0023]1.2.2 配制 10mM 磷酸緩沖液，pH7.5
[0024]a.配制 10mL IM 的 K2HPO4溶液和 10mL IM 的 KH 孑04溶液；
[0025]b.分別取70mL IM的K2HPO4溶液和20mL IM的KH孑04溶液；
[0026]c.用 IM 的 KH2PO4S液調整 pH 至 7.5 ;
[0027]d.加水將IM的磷酸緩沖液稀釋為10mM濃度。
[0028]1.2.3 配制 EMS 溶液
[0029]分別取5mL磷酸緩沖液，根據不同的EMS濃度，向緩沖液中緩慢滴加EMS溶液，終濃度(v/V)為0.3%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及1.0%，注意不要接觸皮膚，帶好口罩。滴加EMS溶液需在通風櫥內進行，以免揮發氣體對人體造成傷害。EMS滴入后呈油滴狀，需振湯混勾。
[0030]1.2.4向各個EMS濃度梯度溶液中加入浸泡好的生菜種子，進行誘變處理
[0031]每一個濃度和時間梯度，分別重復三次，每個重復處理100粒生菜種子。分別在不同的時間梯度計算不同EMS濃度下種子的發芽率，確定最佳處理濃度和時間。
[0032]1.2.5 配制 IM 的 NaOH 溶液
[0033]將接觸過EMS溶液的全部實驗用品浸泡于NaOH溶液中，將處理過種子的EMS溶液同樣倒入NaOH溶液，進行去毒性處理，處理過的溶液可作為正常廢液倒掉。EMS為據毒性化學試劑，必須進行去毒性處理方可倒掉，以免污染環境，對他人造成傷害。
[0034]2實驗結果
[0035]在不同的時間梯度，分別計算生菜種子的出芽率。以水處理為對照，出芽率為95%，說明種子出芽良好。EMS誘變的不同濃度不同時間處理結果顯示(如圖)，3% (v/V)處理1h及0.5% (v/V)處理6h效果最佳，但由于濃度0.3% (v/V)處理1h時間過長，不利于種子發育，因此最終選擇0.5% (v/V)處理6h為最佳。
【主權項】
1.構建生菜突變體庫的EMS誘變濃度篩選，其特征在于:分別設定不同的EMS濃度梯度和處理的時間梯度，進行生菜種子的誘變；篩選最佳處理濃度和時間，種子出芽率達到50%，同時要保證篩選到的濃度不宜過高、處理時間不宜過長，盡量減少EMS的用量，縮短處理時間。2.根據權利要求1所述的構建生菜突變體庫的EMS誘變濃度篩選，其特征在于:通過篩選最佳EMS誘變濃度和時間，能夠在最大容量上構建生菜突變體庫，為后期篩選目標性狀突變體、結合Tilling等分子生物學技術篩選突變基因奠定基礎。3.根據權利要求1或2所述的構建生菜突變體庫的EMS誘變濃度篩選，其特征在于:篩選最佳EMS誘變濃度和時間，構建生菜突變體庫，為篩選目標性狀，結合分子生物學手段改造生菜性狀提供依據。
【專利摘要】生菜具有雜交困難的問題，通過傳統育種手段獲得生菜雜交品種有很大的局限性，也使得生菜的種質資源開發受到限制。因此，為獲得性狀優良的生菜品種，可以從基因水平對其進行改造。通過獲得大量的生菜突變體，從中篩選有義性狀，結合分子生物學手段，獲得與目標性狀連鎖的基因，為后期在基因水平上改造生菜的性狀奠定基礎。EMS是目前最常用的構建植物突變體庫的化學試劑。本研究以生菜為材料，篩選最佳的EMS誘變濃度和誘變時間，達到生菜出芽率50%的目標，構建生菜突變體庫，為后期進行生菜目標性狀的篩選奠定基礎。
【IPC分類】A01C1/00, A01H1/06
【公開號】CN105580523
【申請號】CN201510117357
【發明人】張麗麗, 龔繁榮, 宋云鵬
【申請人】上海市農業科學院, 上海市科園種子有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2015年3月18日