一種靖西細筒苣苔組培葉片兩步成苗方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及靖西細筒苣苔組培葉片兩步成苗方法。
【背景技術】
[0002] 靖西細筒苣苔為苦苣苔科細筒苣苔屬植物，是2011年發現的新種，靖西細筒苣苔 為多年生草本，根狀莖圓柱形，葉片腎形或圓形，花序梗、花序和花期外被線狀短柔毛和紫 色腺體，花期5-6月，果期6月。中國特有珍稀植物，特產廣西靖西，生于石灰巖山地巖石上， 海拔約為200-250m。
[0003] 靖西細筒苣苔分布區域極其狹窄，目前僅在廣西靖西地區石灰巖山陡崖上發現少 量植株，由于生長環境惡劣缺少水肥，加之其種子細小，萌發需要的溫度范圍、濕度范圍和 土壤酸堿度范圍比較小，自然界難以進行有性繁殖，急需建立有效的繁育和保護體系，本發 明旨在通過組織培養技術葉片兩步成苗方法對靖西細筒苣苔種質資源進行有效的繁育和 保護，是目前對靖西細筒苣苔育苗最便捷、穩定的手段，可以節約大量的人力、物力和場地， 便于種質交換和轉移，避免有害病蟲的人為傳播。
【發明內容】
[0004] 本發明目的在于提供一種靖西細筒苣苔組培葉片兩步成苗方法，能夠短時間內提 供大量優質適合栽培的靖西細筒苣苔種苗。
[0005] 為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下技術方案： 靖西細筒苣苔組培葉片兩步成苗方法，其特征在于： (1) 葉片誘導分化不定芽培養:取靖西細筒苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45s，無菌水2~3次，投入0.1% Hcl2 5min,無菌水2~3次，0.1% Hcl2 3min，無菌水2~3次沖洗 干后切分為0.5 cmXl cm大小接種在誘導及分化培養基上，在溫度為22~26° C，光照強度 1800~26001ux，光照時間為8~10小時/天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽； (2) 不定芽壯苗生根培養:選擇靖西細筒苣苔葉片分化1~1.5個月高2~3cm不定芽接種 到壯苗生根培養基，在溫度為22~26° C，光照強度2000~28001ux，光照時間為8~10小時/天的 條件下進行培養，1~2個月不定芽長至高4~6cm的無菌苗。
[0006] 當無菌苗每株生根4條以上、根長達2.5~4cm時，打開瓶蓋，在室內煉苗3~4天后，將 組培苗從培養瓶中取出，洗去培養基，將其移栽至滅菌的栽培基質中。
[0007] 采用本發明所述方法得到的種苗健壯、成活率高，可在短期內提供大量靖西細筒 苣苔的優質種苗，并減少了配制培養基和轉瓶的步驟，節約了大量人力物力，因此簡單易 行、生產成本降低，有效解決了靖西細筒苣苔規模化育苗及種質資源保存問題。
【具體實施方式】
[0008] 下面結合實施例對本發明的技術方案進一步說明。
[0009] 靖西細筒苣苔組培葉片兩步成苗方法法，包括以下步驟： (1)葉片誘導分化不定芽培養:取靖西細筒苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45s，無菌水2~3次，投入0.1% Hch 5min,無菌水2~3次，0.1% Hch 3min，無菌水2~3次沖洗 干后切分為0.5 cmXl cm大小接種在誘導及分化培養基上，在溫度為22~26° C，光照強度 1800~26001ux，光照時間為8~10小時/天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽，觀察發現， 6-BA和NAA濃度對不定芽數誘導有顯著影響，在6-BA濃度為1.5mg/L，NAA濃度為1.0 mg/L， KT濃度為0.2 mg/L時不定芽數最高，達到11.6個。 表i不同激素對不定芽數的影_
[0010] 上述誘導及分化培養基為：以MS為基本培養基，每升添加6-芐氨基嘌呤1~2.0 mg、 α-萘乙酸0.3~lmg、激動素0.2~0.5 mg、瓊脂3.8~4.5 g和蔗糖20~25 g，pH值5.8~6.0,培養 溫度為24 ± 2° C，光照強度1800~26001UX，光照時間為8~10小時/天。
[0011] (2)不定芽壯苗生根培養:選擇靖西細筒苣苔葉片分化1~1.5個月高2~3cm不定芽 接種到壯苗生根培養基，在溫度為22~26° C，光照強度2000~28001UX，光照時間為8~10小時/ 天的條件下進行培養，1~2個月不定芽長至高4~6cm的無菌苗。觀察發現，在添加0.5g/L活 性炭的MS培養基中6-BA和IAA協同作用對靖西細筒苣苔生根效果好，當6-BA濃度升高為0.6 mg/L，NAA濃度為1.0 mg/L時靖西細筒苣苔組培苗生根效果最好，植株粗壯，植株高度 5 · 3cm，生根率達到100%，平均根數達到6根。 表2不同激素水平對不定根效果的影明
[0012] 當無菌苗每株生根4條以上、根長達2.5~4cm時，打開瓶蓋，在室內煉苗3~4天后，將 組培苗從培養瓶中取出，洗去培養基，將其移栽至滅菌的栽培基質中。
[0013] 備注：6-BA(6-節氨基嘌呤），NAA(萘乙酸），KT(激動素），IAA(B引噪乙酸），AC (活性炭）。
【主權項】
1. 一種靖西細筒苣苔葉片組培兩步成苗方法，其特征在于： (1) 葉片誘導分化不定芽培養：取靖西細筒苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45s，無菌水2~3次，投入0.1% Hcl2 5min,無菌水2~3次，0.1% Hcl2 3min，無菌水2~3次沖洗 干后切分為0 · 5 cmX lcm大小接種在MS+ 1 · 0~1 · 5mg/L6_BA+0 · 5~1 · 0mg/LNAA+0 · 1~0 · 2mg/L KT誘導及分化培養基上，在溫度為22~26° C，光照強度1800~26001ux，光照時間為8~10小時/ 天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽； (2) 不定芽壯苗生根培養:選擇靖西細筒苣苔葉片分化1~1.5個月高2~3cm不定芽接種 到MS+0 · 2~0 · 4mg/L6-BA+l · 0~1 · 5mg/LNAA+0 · 5mg/L AC壯苗生根培養基，在溫度為22~26° C， 光照強度2000~28001UX，光照時間為8~10小時/天的條件下進行培養，1~2個月不定芽長至 高4~6cm的無菌苗。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于： (1) 葉片誘導分化不定芽培養：取靖西細筒苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45s，無菌水2~3次，投入0.1% Hcl2 5min,無菌水2~3次，0.1% Hcl2 3min，無菌水2~3次沖洗 干后切分為0.5 cmXl cm大小接種在MS+ 1.5~2.0mg/L6_BA+0.5~1.0mg/LNAA+0.2~0.4mg/ L KT誘導及分化培養基上，在溫度為22~26°C，光照強度1800~26001ux，光照時間為8~10小 時/天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽， (2) 不定芽壯苗生根培養:選擇靖西細筒苣苔葉片分化1~1.5個月高2~3cm不定芽接種 到MS+0 · 2~0 · 4mg/L6-BA+l · 0~1 · 5mg/LNAA+0 · 5mg/L AC壯苗生根培養基，在溫度為22~26° C， 光照強度2000~28001UX，光照時間為8~10小時/天的條件下進行培養，1~2個月不定芽長至 高4~6cm的無菌苗。
【專利摘要】一種靖西細筒苣苔葉片組培兩步成苗方法：取靖西細筒苣苔幼嫩葉片作為外植體進行滅菌處理，然后將其切分成含主脈0.5？cm×1？cm大小后接種到誘導及分化培養基上，1？~1.5個月后選擇幼嫩葉片上分化出的具有2片以上葉子、高1~2.5cm的無菌芽苗轉接到壯苗生根培養基上；當無菌苗每株生根4條以上、根長達2.5~4cm時，煉苗3~4天，將組培苗從培養瓶中取出，將其移栽至滅菌的栽培基質中。采用本發明方法得到的種苗健壯、成活率高，可在短期內提供大量靖西細筒苣苔的優質種苗，并減少了配制培養基和轉瓶的步驟，節約了大量人力物力，因此簡單易行、生產成本降低，有效解決了靖西細筒苣苔規模化育苗及種質資源保存問題。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105519447
【申請號】CN201610108416
【發明人】李翠, 張占江, 繆劍華, 韋坤華, 韋瑩, 李林軒, 王一諾, 肖冬, 王曉峰
【申請人】廣西壯族自治區藥用植物園
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年2月29日