一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物生物技術方法，特別是一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002]山豆根，也稱廣豆根、南豆根，為豆科植物越南槐(Sophora tonkinensisGapnep.)的干燥根及根莖，分布于我國南部，以廣西產量最大。具有清火解毒、消腫止痛等功效，可以治療喉癰、喉風、喉痹、牙齦腫痛、喘滿熱咳、肝炎、便秘、黃疸、下痢、痔疾、禿瘡、疥癬及蚊、蟲、犬咬傷等。醫藥工業用山豆根作為原料，大量研制開發治療肝炎的針劑、咽喉腫痛的片劑以及抗腫瘤的中成藥，同時工業上也用于提取苦參堿、氧化苦參堿等成分，廣泛應用于制藥和植物源農藥的生產。
[0003]山豆根生長緩慢，分布零星。由于用藥量的增加以及使用途徑的拓展，山豆根的市場需求量不斷增大，藥材的價格也不斷上漲，從而導致山豆根資源的無節制采挖，野生資源瀕臨枯竭。毛狀根因具有生長速度快、遺傳穩定性好、合成能力強且穩定、向培養基中釋放部分代謝產物等特點，是生產藥用植物次生代謝產物的立項載體。為了緩解野生資源的壓力，減少野生資源的使用，許多企業開始利用毛狀根發酵的途徑來生產工業用次生代謝產物的替代資源。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，它能夠快速的繁殖山豆根毛狀根，以供后續大規模培養生產工業用山豆根的替代資源。
[0005]本發明通過以下技術方案達到上述目的:一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)無菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.1￥八％升汞消毒lOmin，再用無菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養基中，放置在培養室內進行萌發，獲得山豆根無菌苗子葉，其中MS培養基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養基的pH值為5.8;
[0007](2)R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根:將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養基上培養3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個無菌子葉。當誘導出的根長至約2cm時，在無菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養基上進行除菌培養，每5d轉接I次，直至無菌，獲得無菌毛狀根。
[0008](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養液中進行快速繁殖，培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的，其中1/2MS繁殖培養液中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1-1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養基的pH值為5.8。
[0009]本發明的突出優點在于:
[0010](I)采用本方法進行山豆根毛狀根繁殖，具有生長速度快、遺傳穩定性好、合成能力強且穩定、向培養基中釋放部分代謝產物等特點，繁殖倍數達到39-55倍，是生產次生代謝產物理想的載體。
[0011](2)本方法獲得的毛狀根易于進行大量繁殖培養，能夠進行大規模生產以作為工業用山豆根的替代資源來提取苦參堿、氧化苦參堿等次生代謝產物，滿足工業需要，具有重大應用前景。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發明的技術方案進一步說明。
[0013]實施例1
[0014]本發明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的一個實例，包括以下步驟:
[0015](I)無菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.1?八％升汞消毒lOmin，再用無菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養基中，放置在培養室內進行萌發，獲得山豆根無菌苗，其中MS培養基中添加30g//L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8;
[0016](2)R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根:將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養基上培養3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個無菌子葉。當誘導出的根長至約2cm時，在無菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養基上進行除菌培養，每5d轉接I次，直至無菌，獲得無菌毛狀根。
[0017](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養液中進行快速繁殖，培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的，其中1/2MS繁殖培養液中含0.lmg/L的吲哚乙酸IAA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、0.lmg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數為39倍。
[0018]實施例2
[0019]本發明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的另一個實例，包括以下步驟:
[0020](I)無菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用無菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養基中，放置在培養室內進行萌發，獲得山豆根無菌苗子葉，其中MS培養基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養基的pH值為5.8;
[0021](2)R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根:將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養基上培養3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個無菌子葉。當誘導出的根長至約2cm時，在無菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養基上進行除菌培養，每5d轉接I次，直至無菌，獲得無菌毛狀根；
[0022](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養液中進行快速繁殖，培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的，其中1/2MS繁殖培養液中含0.8mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數為55倍。
[0023]實施例3
[0024]本發明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的一個實例，包括以下步驟:
[0025](I)無菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用無菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養基中，放置在培養室內進行萌發，獲得山豆根無菌苗子葉，其中MS培養基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養基的pH值為5.8;
[0026](2)R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根:將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養基上培養3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個無菌子葉。當誘導出的根長至約2cm時，在無菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養基上進行除菌培養，每5d轉接I次，直至無菌，獲得無菌毛狀根；
[0027](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養液中進行快速繁殖，培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的，其中1/2MS繁殖培養液中含0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數為45倍。
[0028]實施例4
[0029]本發明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的一個實例，包括以下步驟:
[0030](I)無菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用無菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養基中，放置在培養室內進行萌發，獲得山豆根無菌苗子葉，其中MS培養基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養基的pH值為5.8;
[0031](2)R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根:將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養基上培養3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個無菌子葉。當誘導出的根長至約2cm時，在無菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養基上進行除菌培養，每5d轉接I次，直至無菌，獲得無菌毛狀根；
[0032](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養液中進行快速繁殖，培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的，其中1/2MS繁殖培養液中含1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、1.0mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數為46倍。
【主權項】
1.一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)無菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.1￥八％升汞消毒lOmin，再用無菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養基中，放置在培養室內進行萌發，獲得山豆根無菌苗子葉，其中MS培養基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的PH值為5.8; (2)R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根:將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉移至添加乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養基上培養3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個無菌子葉，當誘導出的根長至約2cm時，在無菌條件下將其剪下，于添加頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養基上進行除菌培養，每5d轉接I次，直至無菌，獲得無菌毛狀根； (3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS繁殖培養液中進行快速繁殖，培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的，其中1/2MS繁殖培養液中添加0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸ΙΑΑ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養基的pH值為5.8。
【專利摘要】一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)取山豆根種子進行消毒后接種到1/2MS培養基中萌發，獲得山豆根無菌苗；(2)用R1601發根農桿菌誘導山豆根無菌子葉發根；(3)將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于培養液中進行快速繁殖培養，繁殖倍數達到39-55倍，通過本發明所獲得的山豆根毛狀根具有生長速度快、遺傳穩定性好、合成能力強且穩定、向培養基中釋放部分代謝產物的特點，能夠用于大規模生產生產工業用山豆根的替代資源。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105494090
【申請號】CN201510862709
【發明人】李林軒, 韋坤華, 韋范, 繆劍華, 李翠, 韋瑩, 王一諾, 肖東
【申請人】廣西壯族自治區藥用植物園
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年11月30日