一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及烏羽玉技術領域，具體涉及一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法。
【背景技術】
[0002]烏羽玉(Lophophora williamsii)為仙人掌科烏羽玉屬植物，原產于墨西哥北部，其形態獨特，是很受歡迎的小型觀賞多肉植物的著名代表種之一。此外，烏羽玉還具有重要的藥用價值，對于治療哮喘、肺癌及精神疾病等有顯著療效。但是，烏羽玉生長速度較慢、自然繁殖率低，加之人類過度采掘和對其原產地生存環境的破壞，目前烏羽玉的數量較少、價格不菲，這使得其推廣和應用受到很大限制。因此，利用植物組織培養技術進行烏羽玉的快速繁殖，對于保存優良種質資源、繁殖名優珍稀品種具有重要的意義，以實現其規模化生產以滿足國內外市場的需求。植物組織培養方法可以在短期內快使植物速繁殖，不僅繁殖速度塊，且因為是無性繁殖可以保持與母株的一致的遺傳性狀。但是，在此之前還沒有關于建立烏羽玉組培再生體系的報道，更沒有成功的實例。
【發明內容】
[0003]本發明的目的正是為了克服上述技術的不足，而提供一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法。
[0004]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，包括如下步驟:
[0005]1)、培養基的配制，培養基包括基本培養基和組培各階段培養基的組分具體為:
[0006](1)基本培養基:MS或1/2MS，其中蔗糖20?30g/L，瓊脂6?9g/L，pH=5.8;
[0007](2)誘導培養基:MS+6-BA 0.25?0.5mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L;
[0008](3)分化培養基:MS+6-BA 0.01 ?0.05mg/L;
[0009](4)增殖培養基:MS+6-BA 0.05?0.2mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L;
[0010](5)壯苗生根培養基:MS+6-BA 0.01 ?0.05mg/L+NAA 0.1?0.3mg/L;
[0011]2)種子的消毒及接種:以烏羽玉的種子為外植體材料，將消毒處理后的種子在無菌條件下接種于基本培養基上培養；
[0012]3)愈傷組織的誘導及分化:將步驟2)萌發后的幼苗轉移至誘導培養基上誘導愈傷組織形成并進行不定芽球的分化培養；
[0013]4)不定芽的增殖:將步驟3)的不定芽球接種于增殖培養基上進行增殖培養；
[0014]5)壯苗及生根培養:將步驟4)不定芽球分成單個后轉至壯苗生根培養基上進行壯苗及生根培養。
[0015]進一步地，本發明在所述步驟2)中，以烏羽玉的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用飽和的洗衣粉溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比濃度為70%的酒精和有效氯濃度為1 %的次氯酸鈉溶液中分別浸泡50s和6min，最后用無菌水沖洗3?5遍，每遍2min(移液槍操作)。
[0016]進一步地，本發明在所述步驟3)中，種子培養4?6周后陸續萌發，萌發后的烏羽玉在誘導培養基上培養2?4周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態較好的愈傷組織至于分化培養基上培養，約6周后愈傷組織開始分化不定芽球。
[0017]進一步地，本發明在所述步驟5)中，將再生的不定芽球分別切下后轉至基本培養基上進行壯苗培養，培養3?5周后成為具有根系的壯苗。
[0018]進一步地，本發明在所述步驟3)、4)、5)中，所述的培養條件是，培養溫度為23土 2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天；
[0019]本發明的有益效果是:利用植物組織培養技術對烏羽玉進行了播種及再生快繁培養，能夠在較短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優質壯苗，克服了常規繁殖方法慢的缺點，對其規模化生產和種質資源保存都具有積極意義，同時本技術也為其遺傳轉化體系的建立奠定了堅實的實驗基礎。
【具體實施方式】
[0020]下面通過【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于下述實施例。
[0021]實施例1:
[0022]本發明提供了一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其步驟為:
[0023]1)、培養基的配制
[0024](1)基本培養基:MS或1 /2MS，其中蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH=5.8;
[0025](2)誘導培養基:MS+6-BA 0.25?0.5mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L;
[0026](3)分化培養基:MS+6-BA 0.01 ?0.05mg/L;
[0027](4)增殖培養基:MS+6-BA 0.05?0.2mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L;
[0028](5)壯苗生根培養基:MS+6-BA 0.01 ?0.05mg/L+NAA 0.1?0.3mg/L;
[0029]2)、種子的消毒及接種
[0030]以烏羽玉的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比濃度為70 %的酒精和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡50s和6min，最后用無菌水沖洗3?5遍，每遍2min(移液槍操作)。
[0031 ] 3)、愈傷組織的誘導及分化
[0032]種子培養4?6周后陸續萌發，萌發后的烏羽玉在誘導培養基上培養2?4周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態較好的愈傷組織至于分化培養基上培養，約6周后愈傷組織開始分化不定芽;培養溫度為25±2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天；
[0033]4)、不定芽的增殖
[0034]將烏羽玉的不定芽叢接種于增殖培養基上進行增殖培養;培養溫度為23±2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天；
[0035]5)、壯苗生根培養
[0036]將增殖芽叢在無菌條件下切割成單株后轉接到基本培養基上進行壯苗生根培養，培養3?5周天后成為具有根系的壯苗；培養溫度為23±2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天。
[0037]實施例2
[0038]本發明提供了一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其步驟為:
[0039]1)、培養基的配制
[0040](1)基本培養基:MS培養基，其中蔗糖20?30g/L，瓊脂6?9g/L，pH=5.8;
[0041 ] (2)誘導培養基:MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.05mg/L；
[0042](3)分化培養基:MS+6_BA 0.05mg/L；
[0043](4)增殖培養基:MS+6-BA 0.lmg/L+NAA0.02mg/L；
[0044](5)壯苗生根培養基:MS+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.2mg/L；
[0045]2)、種子的消毒及接種
[0046]以烏羽玉的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比濃度為70 %的酒精和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡50s和6min，最后用無菌水沖洗3?5遍，每遍2min(移液槍操作)。
[0047]3)、愈傷組織的誘導及分化
[0048]種子培養4?6周后陸續萌發，萌發后的烏羽玉在誘導培養基上培養2?4周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態較好的愈傷組織至于分化培養基上培養，約6周后愈傷組織開始分化不定芽;培養溫度為23±2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天；
[0049]4)、不定芽(球)的增殖
[0050]將烏羽玉的不定芽(球)叢接種于增殖培養基上進行增殖培養;培養溫度為23±2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天；
[0051]5)、壯苗培養
[0052]將增殖不定芽(球)在無菌條件下切割成單球后轉接到基本培養基上進行壯苗培養，培養3?5周天后成為具有根系的壯苗;培養溫度為23土2°C、光照強度為60?ΙΟΟμηιοΙ.m—2.s—1、光照時間為10?16小時/天。
[0053]最后需要說明的是，除本實施例外，本發明還可以有其它實施方式和變形，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。凡本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:包括如下步驟: 1 )、培養基的配制，培養基包括基本培養基和組培各階段培養基的組分具體為: (1)基本培養基:MS或1/2MS，其中蔗糖20?30g/L，瓊脂6?9g/L，pH=5.8; (2)誘導培養基:MS+6-BA0.25?0.5mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L ； (3)分化培養基:MS+6-BA0.01 ?0.05mg/L ； (4)增殖培養基:MS+6-BA0.05?0.2mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L ； (5)壯苗生根培養基:MS+6-BA0.01?0.05mg/L+NAA 0.1?0.3mg/L; 2)種子的消毒及接種:以烏羽玉的種子為外植體材料，將消毒處理后的種子在無菌條件下接種于基本培養基上培養； 3)愈傷組織的誘導及分化:將步驟2)萌發后的幼苗轉移至誘導培養基上誘導愈傷組織形成并進行不定芽球的分化培養； 4)不定芽的增殖:將步驟3)的不定芽球接種于增殖培養基上進行增殖培養； 5)壯苗及生根培養:將步驟4)不定芽球分成單個后轉至壯苗生根培養基上進行壯苗及生根培養。2.根據權利要求1所述的烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟2)中，以烏羽玉的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比濃度為70 %的酒精和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡50s和6min，最后用無菌水沖洗3?5遍，每遍2min03.根據權利要求1所述的烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟3)中，種子培養4?6周后陸續萌發，萌發后的烏羽玉幼苗轉接至誘導培養基上誘導愈傷組織形成，挑取生長狀態較好的愈傷組織至于分化培養基上培養，6周后愈傷組織分化出不定芽球。4.根據權利要求1所述的烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟5)中，不定芽球分成單個后轉至基本培養基上進行壯苗生根培養，培養3?5周后成為具有根系的壯苗。5.根據權利要求1所述的烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟3)、4)、5)中，所述的培養條件是，培養溫度為25±2°C、光照強度為60?ΙΟΟμπιοΙ.nf2.s—1、光照時間為10?16小時/天。
【專利摘要】本發明公開了一種烏羽玉無菌播種及再生體系建立的方法，具體操作步驟如下：1)培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的組分；2)種子消毒及接種；3)愈傷組織的誘導及分化；4)不定芽球的增殖；5)壯苗生根培養。本發明利用植物組織培養技術對烏羽玉進行無菌播種及再生快繁培養，能夠在短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優質壯苗，克服了常規繁殖方法慢的缺點，對其種質資源收集及保存和規模化生產都具有積極意義。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105409773
【申請號】CN201510845443
【發明人】王燕, 汪一婷, 呂永平, 牟豪杰, 陳劍平, 陳志
【申請人】浙江省農業科學院
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月27日