大葉藻離體花序愈傷組織的誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明所屬植物組織培養研究領域，本發明涉及一種大葉藻離體花序愈傷組織的誘導方法。
【背景技術】
[0002]愈傷組織的誘導是植物組織培養技術中最為重要的中間環節，多數植物的無菌苗再生需經歷愈傷組織的誘導這一中間環節，因此，愈傷組織的成功誘導是植物無菌苗再生的重要技術支撐，同時，培養愈傷組織也可成為植物次生代謝物快速生產的一條途徑。
[0003]大葉藻{Zostera marina L.)隸屬于大葉藻科(Zosteraceae)大葉藻屬(Zosiera)，廣布于北半球溫帶的淺水海域如海灣、瀉湖和河流入海口，在我國遼寧、河北和山東近海廣為分布。但近一個世紀里，其種群在全球范圍內大面積衰退。因此，種群恢復研究成為大葉藻科學研究中的重點，其中，不斷有學者試圖通過植物組織培養手段來獲得大葉藻無菌再生苗，以推進大葉藻種群恢復中種苗移栽的研究進程。雖對其的組織培養研究已有一段時間，研究進展卻并不大，日本學者2001年以其莖尖為外植體，歷經180d的培養獲得了少量的愈傷組織；中國海洋大學2011年8月公開了“一種大葉藻屬愈傷組織的誘導方法”專利，采用無菌實生苗的胚根、胚軸、子葉為外植體誘導出了愈傷組織。
[0004]本發明以大葉藻花序為外植體，短時間內誘導出愈傷組織，目前采用該技術方案的相關專利和文獻未見報導。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種大葉藻離體花序愈傷組織的誘導方法，采用花序為外植體，可有效地獲得愈傷組織，為大葉藻的快速繁殖和無菌組培苗再生提供重要的技術支撐。
[0006]本發明所采用的技術方案為:
本發明的一種大葉藻離體花序愈傷組織的誘導方法，是以大葉藻的花序為誘導愈傷組織的外植體。
[0007]本發明的具體步驟如下:
1)外植體的選取:采集大葉藻花枝，取其健康佛焰苞花序，經表面除雜、清洗后在超凈工作臺內進行消毒處理，剝去佛焰苞花序外的苞葉，得到無菌的花序；
2)愈傷組織的誘導培養:在無菌條件下將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導培養基中，于15_25°C、黑暗條件下進行培養。其中，所述誘導培養基是以改良MS培養基為基礎培養基，并添加水解酪蛋白0-100mg/L、蔗糖或葡萄糖30-80g/L、2，4-D2-20mg/L、瓊脂5-7g/L、海鹽20_30g/L。培養30_40d后可見到花序兩側組織膨大，產生愈傷組織。
[0008]本發明中，所述改良MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的情況下調整其中的硝酸鉀為0-3800mg/L、硝酸銨為0_3300mg/L、磷酸二氫鉀為0_340mg/L、七水硫酸鎂 0-740mg/L、二水氯化鈣 0-880mg/L。
[0009]本發明中，誘導培養基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2，4-D、瓊脂、海鹽分別優選為100mg/L、30 g/L、2mg/L、5g/L、20g/L。
[0010]本發明的優點在于:大葉藻花期可持續3個月之久，因此外植體供體可獲取時間較長；以其花序為外植體，表面消毒效果大大提升；采用改良培養基，愈傷組織獲得時間較短。本發明為大葉藻無菌組培菌再生提供了重要的技術支撐，也為海草組織培養的成功奠定了基礎。
[0011]
【具體實施方式】
[0012]以下實施例僅用于發明本發明，然其并非用以限制本發明，凡采用等同替換或者等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護范圍之內。
[0013]實施例1:一種大葉藻愈傷組織的誘導方法，其實施步驟包括:
1)外植體的選取:采集大葉藻花枝，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉入超凈工作臺內，用10%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝去佛焰苞花序外的苞葉，得到無菌的花序；
2)愈傷組織的誘導培養:將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導培養基中，在20°C、黑暗條件下進行培養，每半月轉接一次。28d后可陸續見到花序兩側組織萌動、開始膨大，逐漸形成愈傷組織，誘導率高達34% ；
3)所述改良MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的情況下調整其中的為硝酸鉀為0-3800 mg/L、硝酸銨為0-3300 mg/L、磷酸二氫鉀為0-340 mg/L、七水硫酸鎂為0-740 mg/L、二水氯化鈣為0-880 mg/L，誘導培養基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2，4-D、瓊月旨、海鹽分別為 100mg/L、30 g/L、2mg/L、5g/L、20g/L。
[0014]實施例2:—種大葉藻愈傷組織的誘導方法，其實施步驟為:
1)外植體的選取:取大葉藻花枝上健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉入超凈工作臺內，用10%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝去佛焰苞花序外的苞葉，得到無菌的花序；
2)愈傷組織的誘導培養:將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導培養基中，在20°C、黑暗條件下進行培養，每半月轉瓶一次。40d后可陸續見到花序兩側組織萌動、開始膨大，逐漸形成愈傷組織，誘導率為26% ；
3)所述改良MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的情況下調整其中的為硝酸鉀為0-3800 mg/L、硝酸銨為0-3300 mg/L、磷酸二氫鉀為0-340 mg/L、七水硫酸鎂為0-740 mg/L、二水氯化鈣為0-880 mg/L，誘導培養基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2，4-D、瓊月旨、海鹽分別為 100mg/L、30 g/L、10mg/L、5g/L、20g/L。
[0015]實施例3:—種大葉藻體細胞胚的誘導方法，其實施步驟為:
1)外植體的選取:取大葉藻花枝上健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉入超凈工作臺內，用10%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝去佛焰苞花序外的苞葉，得到無菌的花序；
2)愈傷組織的誘導培養:將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導培養基中，在20°C、黑暗條件下進行培養，每半月轉接一次。40d后可陸續見到花序兩側組織萌動、開始膨大，逐漸形成愈傷組織，誘導率為7% ；
3)所述改良MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的情況下調整其中的為硝酸鉀為0-3800 mg/L、硝酸銨為0-3300 mg/L、磷酸二氫鉀為0-340 mg/L、七水硫酸鎂為0-740 mg/L、二水氯化鈣為0-880 mg/L，誘導培養基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2，4-D、瓊月旨、海鹽分別為 100mg/L、30 g/L、20mg/L、5g/L、20g/L。
【主權項】
1.一種大葉藻愈傷組織的誘導方法，其特征在于，是以大葉藻的花序為誘導愈傷組織的外植體。2.如權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，步驟如下: 1)外植體的選取:采集大葉藻花枝，取其健康佛焰苞花序，經表面除雜、清洗后在超凈工作臺內進行消毒處理，剝去佛焰苞花序外的苞葉，得到無菌的花序； 2)愈傷組織的誘導培養:在無菌條件下將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導培養基中，于15-25 °C、黑暗條件下進行培養；其中，所述誘導培養基是以改良MS培養基為基礎培養基，并添加水解酪蛋白0-100mg/L、蔗糖或葡萄糖30-80g/L、2，4-D2-20mg/L、瓊脂5-7g/L、海鹽20-30g/L ;培養30_40d后可見到花序兩側組織膨大，產生愈傷組織。3.如權利要求2所述的誘導培養方法，其特征在于，所述改良MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的情況下調整其中的硝酸鉀為0-3800mg/L、硝酸銨為0_3300mg/L、磷酸二氫鉀為0-340mg/L、七水硫酸鎂0_740mg/L、二水氯化鈣0_880mg/L。4.如權利要求2所述的誘導培養方法，其特征在于，誘導培養基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2，4-D、瓊脂、海鹽分別優選為 100mg/L、30 g/L、2mg/L、5g/L、20g/L。
【專利摘要】本發明涉及一種大葉藻愈傷組織的誘導方法，是以大葉藻花序為外植體，將經過表面消毒的花序切成3-5mm長接種到愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織的誘導，每半月轉接一次，培養近1個月后花序軸兩側膨大，逐漸形成愈傷組織；所述愈傷組織培養基是以改良MS培養基為基礎培養基，并添加2,4-D、水解酪蛋白、蔗糖、瓊脂和海鹽。本發明采用改良的MS培養基，可有效地促進大葉藻愈傷組織的誘導，為大葉藻組培再生苗的產生和快速繁殖的實現提供重要的技術支撐。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105393914
【申請號】CN201410463124
【發明人】鄭鳳英, 張飛, 劉雪芹, 金艷梅, 張偉, 韓曉弟
【申請人】山東大學（威海）
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2014年9月12日