一種角膜中期保存液及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于角膜保存液制備技術領域，具體涉及一種角膜中期保存液及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 近年來，角膜疾病己成為我國第二大致盲性眼病。但作為一種可治性眼病，通過進 行板層或穿透性角膜移植手術即可使患者重獲光明。按對內皮細胞活性的保存時間，角膜 保存可分為短期、中期和長期保存，中期保存是通過保存液4°C下使角膜內皮細胞活性保持 4天以上的方法，由于操作簡便易行，其已成為目前世界上眼庫廣泛使用的角膜保存方法。
[0003] 角膜內皮為角膜內側的單層細胞，可不斷排出基質中水分而保持角膜透明。角膜 內皮不可逆的損傷將導致角膜混濁，透明度下降，角膜內皮細胞數量和活力對于穿透角膜 移植的術后效果具有重要影響。多項研究表明角膜內皮活細胞數量會隨著保存時間延長而 逐漸減少，從而無法用于穿透性角膜移植，因此有必要提供一種即能提高角膜內皮細胞活 性和延長保存時間的中期角膜液。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了一種角膜中期保存液及其制 備方法，可保護角膜內皮細胞，避免因長時間保存而出現的內皮細胞壞死及融合現象，更有 效地延長角膜保存時間。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案之一是：
[0006] -種角膜中期保存液，該角膜中期保存液為含有硫酸軟骨素、低分子右旋糖酐、 L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM細胞培養基，其中各組分的濃度 如下：硫酸軟骨素20~26g/L、低分子右旋糖酐8~12g/L、L-谷氨酰氨0· 37~0· 38mg/L、 胎牛血清2~5. 5%、妥布霉素0. 08~0. 12g/L、!fepes 9~10g/L、雷帕霉素0. 9~1. InM/ L〇
[0007] -實施例中：所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素25g/L、低分 子右旋糖酐l〇g/L、L-谷氨酰氨0· 375mg/L、胎牛血清5%、妥布霉素0· lg/L、Hepes9. 5g/L、 雷帕霉素 InM/L。
[0008] -實施例中：所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素21g/L、低分 子右旋糖酐9g/L、L-谷氨酰氨(λ 372mg/L、胎牛血清3%、妥布霉素 (λ 09g/L、Hepes 9. 2g/ L、雷帕霉素0. 95nM/L。其余同實施例1。
[0009] -實施例中：所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素24g/L、低分 子右旋糖酐llg/L、L-谷氨酰氨0· 378mg/L、胎牛血清4%、妥布霉素0· llg/L、Hepes 9. 8g/ L、雷帕霉素1. 05nM/L。
[0010] -實施例中：所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素22g/L、低分 子右旋糖酐10. 5g/L、L-谷氨酰氨0· 373mg/L、胎牛血清2. 5%、妥布霉素0· 105g/L、Hepes 9. 6g/L、雷帕霉素 L 02nM/L。
[0011] 一實施例中：所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素23g/L、低分 子右旋糖酐9.5〖凡、1^-谷氨酰氨0.37611^凡、胎牛血清3.5%、妥布霉素0.095〖凡、！16口68 9. 3g/L、雷帕霉素 0· 98nM/L。
[0012] 一實施例中：所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素 20g/L、低分 子右旋糖酐8g/L、L-谷氨酰氨0· 37mg/L、胎牛血清5. 5%、妥布霉素 0· 12g/L、Hepes 10g/ L、雷帕霉素 0. 9nM/L ;或：硫酸軟骨素 26g/L、低分子右旋糖酐12g/L、L-谷氨酰氨0. 38mg/ L、胎牛血清2%、妥布霉素 0. 08g/L、H印es 9g/L、雷帕霉素 1. InM/L。
[0013] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案之二是：
[0014] 上述角膜中期保存液的制備方法，在無菌條件下進行，包括：
[0015] 1)配制MEM培養基；
[0016] 2)取硫酸軟骨素配制成硫酸軟骨素溶液；取低分子右旋糖酐配制成低分子右旋 糖酐溶液；
[0017] 3)按照硫酸軟骨素，低分子右旋糖酐和妥布霉素的終濃度分別為20~26g/L，8~ 12g/L和0. 08~0. 12g/L的比例，在步驟1)的MEM培養基中加入相應量的步驟2)的硫酸 軟骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液，及妥布霉素；
[0018] 4)用！fepes調整步驟3)得到的混合液pH值至7. 2~7. 4,得到所述角膜中期保 存液的儲存液；
[0019] 5)使用前，在步驟4)的儲存液中加入L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素，并使 L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素的終濃度分別為0. 37~0. 38mg/L，2~5. 5%和0. 9~ 1. InM/L，即得所述之角膜中期保存液。
[0020] -實施例中：所述步驟1)中，取MEM培養基粉末9. 4g加入注射用水500ml配制得 到MEM培養基；所述步驟2)中，配制125g/L的硫酸軟骨素溶液和100g/L的低分子右旋糖 酐溶液；所述步驟3)中，MEM培養基，硫酸軟骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液和妥布霉素的 配方比例為500ml :200ml :100ml :0· lg ;所述步驟4)中，Hepes調節pH值后定容至終體積 為 1000ml〇
[0021] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案之三是：
[0022] 上述角膜中期保存液的用途，所述用途是指通過維持角膜內皮細胞活性及正常形 態和/或降低離體角膜內皮細胞的凋亡來延長角膜保存時間。
[0023] 本技術方案與【背景技術】相比，它具有如下優點：
[0024] 本發明的角膜中期保存液通過各組分的協同增效，不僅能維持角膜內皮細胞活性 及正常形態，還能增強角膜內皮細胞的存活能力，尤其是中長期保存效果更為明顯，長期保 存未出現對照組角膜內皮細胞變形、壞死、細胞融合等現象，與保存短時間的角膜內皮形態 一致，細胞仍規則，細胞融合現象少，本發明的保存液能夠很好的避免離體角膜材料保存中 存在的內皮細胞凋亡現象，可使角膜在較長的保存時間內維持透明的特性。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過實施例具體說明本發明的內容：
[0026] 實施例1
[0027] -種角膜中期保存液，該角膜中期保存液為含有硫酸軟骨素、低分子右旋糖酐、 L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM細胞培養基，其中各組分的濃度 如下：硫酸軟骨素 25g/L、低分子右旋糖酐10g/L、L-谷氨酰氨0. 375mg/L、胎牛血清5%、妥 布霉素 0. lg/L、Hepes9. 5g/L、雷帕霉素 InM/L。
[0028] 上述角膜中期保存液的制備方法包括：
[0029] 1)按照MEM培養基的說明書，取MEM培養基粉末9. 4g加入注射用水500ml，溶解 后過濾滅菌，配制得到MEM培養基；
[0030] 2)取硫酸軟骨素25g加入注射用水200ml，溶解后過濾滅菌，配制成125g/L的 硫酸軟骨素溶液；取低分子右旋糖酐（平均分子量20000~40000kD) 10g加入注射用水 100ml，溶解后過濾滅菌，配制成100g/L的低分子右旋糖酐溶液；
[0031] 3)取無菌容器，加入步驟1)的MEM培養基500ml，步驟2)的125g/L硫酸軟骨素 溶液200ml和100g/L的低分子右旋糖酐溶液100ml，并加入妥布霉素0. lg ;
[0032] 4)用！fepes調整步驟3)得到的混合液pH值至7. 2~7. 4,加入注射用水至終體 積為l〇〇〇ml，使得硫酸軟骨素，低分子右旋糖酐和妥布霉素的終濃度分別為25g/L，10g/L 和0. lg/L，得到所述角膜中期保存液的儲存液；檢測滲透壓300~380m0sm/kg H20,將該儲 存液分裝為每l〇ml -支的安瓶，冷藏，經細菌、真菌培養檢測，備用；
[0033] 5)使用前，在步驟4)的儲存液中加入L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素，并使 L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素的終濃度分別為0. 375mg/L，5%和InM/L，即得所述之角 膜中期保存液。
[0034] 實施例2
[0035] 本實施例之中，所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素 21g/L、低 分子右旋糖酐9g/L、L-谷氨酰氨0· 372mg/L、胎牛血清3%、妥布霉素 0· 09g/L、Hepes 9. 2g/ L、雷帕霉素 0. 95nM/L。其余同實施例1。
[0036] 實施例3
[0037] 本實施例之中，所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素24g/L、 低分子右旋糖酐llg/L、L-谷氨酰氨0· 378mg/L、胎牛血清4%、妥布霉素0· llg/L、ifepes 9. 8g/L、雷帕霉素 L 05nM/L。
[0038] 實施例4
[0039] 本實施例之中，所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素 22g/L、低 分子右旋糖酐10. 5g/L、L-谷氨酰氨0· 373mg/L、胎牛血清2. 5%、妥布霉素 0· 105g/L、Hepes 9. 6g/L、雷帕霉素 L 02nM/L。
[0040] 實施例5
[0041] 本實施例之中，所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素 23g/L、低 分子右旋糖酐9. 5g/L、L-谷氨酰氨0· 376mg/L、胎牛血清3. 5%、妥布霉素 0· 095g/L、Hepes 9. 3g/L、雷帕霉素 (λ 98nM/L。
[0042] 實施例6
[0043] 本實施例之中，所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨素 20g/L、低 分子右旋糖酐8g/L、L-谷氨酰氨0. 37mg/L、胎牛血清5. 5%、妥布霉素 0. 12g/L、Hepes 10g/ L、雷帕霉素 0. 9nM/L。
[0044] 實施例7
[0045] 本實施例之中，所述角膜中期保存液中各組分的濃度如下：硫酸軟骨