一種解淀粉芽孢桿菌制劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種解淀粉芽孢桿菌制劑及其應用。
【背景技術】
[0002] 玉米大斑病又稱條斑病、煤紋病、枯葉病、葉斑病等。主要為害玉米的葉片、葉鞘和 苞葉。葉片染病先出現水漬狀青灰色斑點，然后沿葉脈向兩端擴展，形成邊緣暗褐色、中央 淡褐色或青灰色的大斑。后期病斑常縱裂。嚴重時病斑融合，葉片變黃枯死。潮濕時病斑 上有大量灰黑色霉層。下部葉片先發病。在單基因的抗病品種上表現為褪綠病斑，病斑較 小，與葉脈平行，色澤黃綠或淡褐色，周圍暗褐色，有些表現為壞死斑。
[0003] 玉米大斑病的防治方法主要有種植抗病品種、加強農業防治和藥劑防治。藥劑防 治方面主要以化學藥劑為主，而化學藥劑存在污染環境，持效期短，病原菌容易產生抗藥性 等問題，并且現有生物菌劑只是針對防治病原菌，不能起到玉米增產的作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是要解決現有防治玉米大斑病中化學藥劑對環境污染，對人畜不安 全，病菌易產生抗藥性，且對玉米增產效果不明顯的問題，提供了一種解淀粉芽孢桿菌制劑 及其應用。
[0005] 1、本發明一種解淀粉芽孢桿菌制劑按質量分數包含0.01~0.02 %硫酸 鋅，0. 01~0. 02 %硼酸、0. 1~0. 2 %吐溫20和余量的解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol發酵液，其中制備解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01發酵液的發酵培養基每1升的組分含量為：葡萄糖0. 1%、黃豆 粉0.4%、蛋白胨0. 1%、酵母膏0.05%、磷酸二氫鉀0. 12%、硫酸鎂0.024%和余量的水； 發酵條件為：溫度32°C，pH7. 0~7. 2,轉速170r/min，培養時間48h，接種量2%。
[0006] 本發明的一種解淀粉芽孢桿菌制劑的應用是指在抑制玉米大斑病菌的同時增加 玉米產量上的應用。
[0007] 本發明以解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol制備成高效、 廣譜、無毒、無污染的生態型生防微生物菌劑，該菌劑對環境友好，不會使病原菌產生抗藥 性，并通過田間藥效測定，抽雄后40d對玉米大斑病的防效為80. 8%，顯著高于藥劑（多菌 靈）對照60.1%，另外可通過解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01菌 群快速繁殖占領位點，分泌多種抗生物質，可預防多種病害發生；該菌劑在玉米上的應用效 果表明，在常規農技措施條件下，玉米噴施微生物菌劑后能夠明顯促進玉米植株生長和穗 產量的提高，減少突尖率，與噴施空白對照相比穗長、行粒數和百粒重分別增加I. 4cm、l. 8、 2. 4g，玉米增產率為18. 26 %。在使用該菌劑14d，第二次14d，抽雄后20d，抽雄后40d，對玉 米大斑病的防治效果良好，說明該菌劑持效期長。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0008] 一：本實施方式一種解淀粉芽孢桿菌制劑按質量分數包含 0.01~0.02 %硫酸鋅，0.01~0.02 %硼酸、0. 1~0. 2%吐溫20和余量的解淀粉芽 孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol發酵液，其中制備解淀粉芽孢桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens)KBl-Ol發酵液的發酵培養基每1升的組分含量為：葡萄糖 0. 1%、黃豆粉0.4%、蛋白胨0. 1%、酵母膏0.05%、磷酸二氫鉀0. 12%、硫酸鎂0.024%和 余量的水；發酵條件為：溫度32°C，pH7. 0~7. 2,轉速170r/min，培養時間48h，接種量2%。
[0009] 本發明以解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens) KBl-Ol制備成高效、廣 譜、無毒、無污染的生態型生防微生物菌劑，該菌劑對環境友好，不會使病原菌產生抗藥性。
【具體實施方式】 [0010] 二：本實施方式與一不同的是解淀粉芽孢桿菌制劑 按質量分數包含〇. 02%硫酸鋅，0. 02%硼酸、0. 1%吐溫20和99. 86%的解淀粉芽孢桿菌 (Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol發酵液，其他與一相同。
【具體實施方式】 [0011] 三：本實施方式與一或二不同的是：所述的解淀粉芽 孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期是2014年09月12 日，保藏編號為CGMCC No. 9649,其他與一或二相同。
[0012] 本實施方式解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol的篩選方法 為：從黑龍江省農墾哈爾濱、紅興隆、牡丹江、九三、綏化、北安、寶泉嶺七個分局采集玉米根 際土壤樣品15份。
[0013] 將從采集的土樣自然風干。每份土樣稱取10g，放入盛有90ml無菌水和玻璃珠的 三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后用無菌水進行梯度稀釋后涂布PDA平板，于25°C培養 箱內培養24h左右，挑取菌落形態差異明顯的單菌落進入初篩。
[0014] 以玉米大斑病菌為靶標菌，采用平板對峙法篩選所分離的細菌。將供試病原真菌 菌餅（7mm)移至平板中央，，在距離細菌兩側25mm處，劃線接種拮抗菌，以只接病原菌為對 照，每處理3皿。置于25°C培養箱培養4~6天，選出1182株對靶標菌生長有抑制作用的 菌株進入復篩。每個菌株4次重復，同樣的方法培養并測量抑菌圈半徑（細菌菌落中心至 病原菌菌絲邊緣）的大小，篩選出抑菌圈半徑較大，被抑病原菌絲邊緣平齊且拮抗作用持 久的菌株，通過復篩，得到菌株KB1-01，其平均抑菌帶為12. 8mm，抑菌率達到81. 91 %。
[0015] 采用平板對峙生長法培養之后，菌株KB1-01對水稻稻瘟病菌、水稻紋枯病菌、馬 鈴薯早疫病菌、番茄枯萎病菌、禾谷鐮刀菌尖孢鐮刀菌和鏈格孢的抑制作用如表1所示，由 表1可知，菌株KB1-01對不同的病原真菌表現出廣譜的拮抗作用，但菌株KB1-01對不同病 原菌表現出的拮抗強度有所差別，這可能是由于不同的病原真菌的菌絲體構造等有所不同 所造成的。
[0016] 表 1
[0017]
[0018] 篩選得到的解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol的細胞形態 和理化實驗結果如表2所示：
[0019] 表 2
[0022] 對篩選得到的解淀粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01進行分子 鑒定，按以下方法進行：
[0023] 采用CTAB方法提取菌株KBl-Ol的DNA ;采用通用引物對KBl-Ol的DNA進行 擴增和測定；PCR產物純化后進行測序，經測序，待鑒定的樣品16S rDNA片段大小為 1382bp。將此序列與NCBI數據庫中的數據進行序列同源性比對，發現該菌株與解淀粉芽 孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)的親緣關系最近，并最終命名為解淀粉芽孢桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01〇
【具體實施方式】 [0024] 四：本實施方式與一至三之一不同的是：所述的解淀 粉芽孢桿菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol發酵