一種玉米灰斑病的接種方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物灰斑病的接種方法，具體涉及一種玉米灰斑病的接種方法。
【背景技術】
[0002] 玉米灰斑病是玉米生產區主要病害之一，隨著灰斑病在玉米生產造成的危害逐年 加重，對于玉米灰斑病的研究也在不斷深入。近年來，針對玉米灰抗斑病的研究主要涵蓋了 灰斑病致病機理研究、病原菌致病性研究、植株抗病性鑒定及抗性基因定位及克隆等方面， 上述研究的開展均依賴賴于通過自然接種或人工接種方式來實現病原菌對玉米植株進行 侵染，進而引發病害，從而便于研究人員跟蹤調查發病全程。
[0003]目前，玉米灰斑病的發生對氣溫和空氣濕度有較高要求，自然接種和人工接種的 方式均存在各自的不足，因而不能完全滿足試驗的要求。其中，自然接種是在玉米灰斑病流 行區域內種植待接種的玉米材料，待環境溫度及相對濕度適宜時，由殘留在環境中的灰斑 病病原菌對鑒定材料進行侵染進而引發病害。自然接種侵染植株受到季節、地域及年度病 害流行情況等因素限制，只能夠在符合玉米生長的特定季節（如春、夏季）及適宜該病害發 生的地域內進行田間鑒定。該接種方法對于空氣溫度和相對濕度無法調控，從而影響接種 效果；同時自然接種試驗人員無法準確掌握接種時間及侵染發生時間，無法觀察收集接種 前與接種后特定時間節點被侵染植株在生理生化指標上的變化。人工接種需要對灰斑病病 原菌進行人工分離、培養，在大田或大棚環境條件下，通過人工噴施、注射帶菌液或接入帶 菌載體到植株體的方式完成接種，并誘發植株發病，該接種方法雖能夠準確掌控接種時間， 也能夠通過病原菌分離培養步驟獲得純化后灰斑病病原菌，但人工接種侵染植株受到季節 和地域的限制，只能夠在符合玉米生長的特定季節（如春、夏季）進行田間鑒定，面臨植株 接種后空氣溫度和相對濕度變化無法調控影響，接種寄主難以發病，接種成功率不高的問 題；此外，灰斑病病原菌人工條件下生長緩慢，培養期間易受污染也是限制人工接種成功率 的原因之一。
[0004] 因此，如何提高玉米灰斑病的接種成功率，為灰斑病研究提供一種穩定可靠（不 受季節、外部環境和地域等因素的限制）的可控制接種時間的高成功率地人工接種方法成 為了一個亟待解決的問題。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種穩定可靠的玉米灰斑病可控制接種時間 的高成功率地人工接種方法。
[0006] 本發明解決其技術問題采用的技術方案是，一種玉米灰斑病的接種方法，包括以 下步驟：
[0007] (1)喇叭口期玉米植株移栽：將喇叭口期玉米植株（優選小喇叭口期玉米植株） 帶土移栽至直徑40~60cm，深50~70cm的花盆中；
[0008] (2)模擬環境下培養：將移植植株放置于人工氣候培養箱中，設定環境溫度為 20~30°C (優選25°C )，相對濕度為90~100% (優選95% )，白晝時間11~13h(優選 12h)，光照強度2000~3000Lx (優選2500Lx)，黑夜時間為11~13h (優選12h)，光照強度 為OLx，人工氣候箱內培養植株7~IOd (優選9d)，待植株恢復正常生長；
[0009] (3)病原菌收集：對灰斑病典型病斑葉進行水浸泡、水洗脫與離心方式，在短時間 內獲得具有高濃度的灰斑病帶菌液；
[0010] (4)接種：先用清水沖洗待接種的葉片，晾干后再撒上少許500~700目金剛砂， 在接種葉片上輕輕摩擦，要求僅使葉片表皮細胞造成微傷口而不死亡，每天涂抹1~3次， 連續涂抹2~4d，每次涂抹后以保鮮膜覆蓋涂抹菌液部分，保濕3~4d后去掉保鮮膜，以起 到保濕作用。
[0011] 進一步，步驟（3)中，所述水浸泡是用50ml蒸餾水浸泡20g具有灰斑病典型病斑 的葉片，浸泡4h，過濾葉片殘渣，收集浸泡蒸餾水；所述水洗脫是用新的蒸餾水反復洗脫浸 泡后的病斑葉片3~4次，每次用水量50ml，洗脫后收集蒸餾水備用；所述離心是將浸泡病 斑的蒸餾水以6500~7000rap/min轉速離心15~25min，去掉離心管內上清液，保留底部 沉淀，重復離心多次，直至洗脫液全部被離心；最后收集離心管底部沉淀，將其置入Iml蒸 餾水中，充分攪拌均勻，即得帶菌懸濁液。
[0012] 本發明通過人工氣候培養箱真實模擬出灰斑病發病所需要的最佳環境（最適接 種環境溫度、相對濕度及光照強度），在模擬環境中以高濃度病原菌懸濁液涂抹對玉米植株 進行灰斑病人工接種。因此，本發明不受季節、外部環境和地域等因素的限制，有效地提高 了灰斑病人工接種的成功率，能夠準確控制灰斑病的接種時間，有利于觀察和檢測植株在 接種前后特定時間節點的外觀及內部指標動態變化。
[0013] 實踐證明，玉米灰斑病病株率可達95.0%。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0015] 實施例1 :
[0016] 1、玉米灰斑病的接種方法
[0017] (1)喇叭口期玉米植株移栽：將小喇叭口期玉米植株帶土移栽至直徑50cm，深 60cm的花盆中；
[0018] (2)在人工氣候培養箱模擬環境下培養：將移植植株放置于人工氣候培養箱中， 設定環境溫度為25°C，相對濕度為95%，白晝時間12h，光照強度2500Lx，黑夜時間為12h， 光照強度為〇Lx，人工氣候箱內培養植株9天，待植株恢復正常生長。
[0019] (3)病原菌收集：①首選水浸泡：用50ml蒸餾水浸泡20g具有灰斑病典型病斑的 葉片，浸泡4h，過濾葉片殘渣，收集浸泡蒸餾水；②接著水洗脫：用新的蒸餾水反復洗脫浸 泡后的病斑葉片3~4次，每次用水量50ml，洗脫后收集蒸餾水備用；③然后離心：將浸泡 病斑的蒸餾水以6700rap/min轉速離心20min，去掉離心管內上清液，保留底部沉淀，重復 離心多次，直至洗脫液全部被離心；④最后收集離心管底部沉淀，將其置入Iml蒸餾水中， 充分攪拌均勻，即得濃度為5 X IO5個/微升帶菌懸濁液。
[0020] (4)接種：先用清水沖洗待接種的葉片，晾干后再撒上少許金剛砂（600目），以左 手托著葉片，用右手食指蘸取少量灰斑菌懸液。在接種葉片上輕輕摩擦，要求僅使葉片表皮 細胞造成微傷口而不死亡。每天涂抹2次，連續涂抹3d，每次涂抹后以保鮮膜覆蓋涂抹菌液 部分，保濕3~4d后可去掉保鮮膜。
[0021] 2、發病情況調查
[0022] 保持人工氣候培養箱的溫濕度及光照強度在合適的范圍，大喇叭口期移栽玉米至 人工氣候培養箱，根據玉米植株生長狀態及時進行肥水管理，待玉米植株恢復正常生長后 人工接種。接種后15d左右可以通過肉眼觀察到接種葉片出現典型病斑，玉米灰斑病發病 情況調查結果見表1 (三次重復數據）。
[0023] 表1玉米灰斑病發病情況
[0025] 3、寄主發病效果對照數據
[0026] 分別比較了三種接種方法（A :海拔600m的大田環境人工接種；B :海拔1500m的自 然接種；C :海拔600m的大喇叭口期移栽后人工氣候培養箱條件下人工接種）下的玉米灰 斑病發病情況，每種方法設三次重復。玉米灰斑病發病情況見表2。
[0027] 表2玉米灰斑病發病情況
【主權項】
1. 一種玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 喇叭口期玉米植株移栽：將喇叭口期玉米植株帶土移栽至直徑40~60cm，深50~ 70cm的花盆中； (2) 模擬環境下培養：將移植植株放置于人工氣候培養箱中，設定環境溫度為20~ 30°C，相對濕度為90~100%，白晝時間11~13h，光照強度2000~3000Lx，黑夜時間為 11~13h，光照強度為OLx，人工氣候箱內培養植株7~10d，待植株恢復正常生長； (3) 病原菌收集：對灰斑病典型病斑葉進行水浸泡、水洗脫與離心方式，在短時間內獲 得具有高濃度的灰斑病帶菌液； (4) 接種：先用清水沖洗待接種的葉片，晾干后再撒上少許500~700目金剛砂，在接 種葉片上輕輕摩擦，要求僅使葉片表皮細胞造成微傷口而不死亡，每天涂抹1~3次，連續 涂抹2~4d，每次涂抹后以保鮮膜覆蓋涂抹菌液部分，保濕3~4d后去掉保鮮膜。2. 根據權利要求1所述的玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，步驟（1)中，所述喇叭 口期玉米植株為小喇叭口期玉米植株。3. 根據權利要求1或2所述的玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，步驟⑵中，所述 設定環境溫度為25°C，相對濕度為95%，白晝時間12h，光照強度2500Lx，黑夜時間為12h， 光照強度為〇Lx，人工氣候箱內培養植株9d。4. 根據權利要求1~3之一所述的玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，步驟（3)中， 所述水浸泡是用50ml蒸餾水浸泡20g具有灰斑病典型病斑的葉片，浸泡4h，過濾葉片殘渣， 收集浸泡蒸餾水；所述水洗脫是用新的蒸餾水反復洗脫浸泡后的病斑葉片3~4次，每次用 水量50ml，洗脫后收集蒸餾水備用；所述離心是將浸泡病斑的蒸餾水以6500~7000rap/ min轉速離心15~25min，去掉離心管內上清液，保留底部沉淀，重復離心多次，直至洗脫液 全部被離心；最后收集離心管底部沉淀，將其置入Iml蒸餾水中，充分攪拌均勻，即得帶菌 懸濁液。
【專利摘要】一種玉米灰斑病的接種方法，包括以下步驟：(1)喇叭口期玉米植株移栽；(2)在人工氣候培養箱真實模擬環境下培養；(3)病原菌收集；4)接種。本發明不受季節、外部環境和地域等因素的限制，有效地提高了灰斑病人工接種的成功率，能夠準確控制灰斑病的接種時間，有利于觀察和檢測植株在接種前后特定時間節點的外觀及內部指標動態變化。
【IPC分類】A01G1/00
【公開號】CN105123175
【申請號】CN201510434473
【發明人】何文鑄, 張彪, 楊麟, 冷益豐, 蘭海, 陳潔, 李蘆江, 譚君, 徐國倫, 楊俊品, 蔡明鴻, 康繼偉, 黃維藻, 唐海濤, 李政, 何遠遠
【申請人】四川省農業科學院作物研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年7月22日