一種金線蓮種苗的擴繁方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種金線蓮種苗的擴繁方法，屬于金線蓮種苗高效擴繁育苗技術領 域。
【背景技術】
[0002] 金線蓮（Anoecthilus roxburghii)為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，別名為金線 蘭、金絲草、樹草蓮、金線虎頭蕉等。通常生長在蔭蔽闊葉林下的肥沃腐葉土中，是我國傳統 的珍貴藥材，有清涼解毒、滋陰降火、消炎止痛的功效，且無毒副作用，在民間素有"藥王"的 美譽。金線蓮株高8~20cm，株型小巧，葉型優美，葉脈金黃色、呈網狀排列，又是觀賞價值 極高的室內觀葉珍品。隨著信息社會的日益發達，金線蓮的功效被越來越多的醫學家們的 認可和推崇。但是金線蓮種子微小，胚發育不完全，在自然條件下極難出芽，對生長環境的 要求極為苛刻，生長緩慢，天然產量極低。若以分根或扦插繁殖，則耗時長且繁殖系數低，而 且金線蓮賴以生存的自然環境發生變化，野生資源銳減，加之長期采挖，種質資源稀缺，已 瀕臨滅絕，已不能滿足臨床需求。目前福建臺灣等地雖有一批專業種植戶涌現，但是其栽培 種植工藝保守，導致金線蓮培育效率低下，產量無法滿足國內需求。目前在江浙地帶，金線 蓮的需求量日益增長，巨大的市場需求無法得到滿足，在利益驅動下，產生了一些非正常的 金線蓮育苗手段，導致金線蓮產品更加良莠不齊。
[0003] 應用植物組培快繁方法在一定程度上解決了金線蓮種苗短缺的現象，有關金線蓮 的快速繁殖技術國內多有報道。但是現有的應用植物組培的方法生產金線蓮種苗，消耗大 量的人力、物力，生產成本居高不下，且培養周期長，種苗質量不高，仍不能滿足藥農的需 求。另外在中國專利文獻CN101213942A中披露了一種藥用金線蓮組織培養一步成苗快速 繁殖方法，但是培養時間過長，效率低下。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足，提供一種金線蓮種苗的擴繁方 法，該擴繁方法步驟簡單，生產周期與傳統工藝相比大幅減短，成本也降低，對環境友好，適 合工業化生產，既能夠大幅度提高金線蓮的種苗培育效率，又可以提高整個市場金線蓮產 品的質量。
[0005] 按照本發明提供的技術方案：一種金線蓮種苗的擴繁方法，其特征在于包括如下 步驟：
[0006] (1)外植體的培養和接種：挑選高度為7~10cm、帶有4~6片葉、具有3~4節間 的成年金線蓮原種植株，在至少連續三個太陽照射之后的晴天，采集整株植株作為外植體， 先用堿性清潔劑清洗，再用清水反復沖洗至無泡沫為止；然后將外植體滅菌，滅菌后無菌切 去葉片、頂芽和根須，切1~2節間為一段，接種到Jl固體培養基中，進行誘導休眠芽生長， 誘導培養條件為：光照強度3000~5000Lx，光照時間16~18小時/天，溫度22~28°C， 培養時間35~45天；休眠芽誘導成功后，挑選強壯的植株作為擴繁種苗；
[0007] (2)通過搖床進行高效率擴繁：將擴繁種苗移入到J2液體培養基中，放置于搖床 上進行第一次繼代培養，第一次繼代培養條件為：搖床光照強度3000~5000Lx，溫度22~ 28 °C，搖動頻率95次/分鐘，培養時間20天；第一次繼代培養獲得擴繁比率為1 : (20~30) 的胚芽體，然后將胚芽體切分為2~3個主苗，發芽較多的主苗留在搖床上用新的J2液體 培養基繼續培育新芽，進行第二次的繼代培養，其余主苗移入Jl固體培養基作種植前期培 養；
[0008] (3)固體培養基內生長培養：移入Jl固體培養基中的主苗作種植前期培養，培養 條件為：光照強度3000~5000Lx，光照時間16~18小時/天，溫度22~28°C ;每35天 繼代培養1次，每次繼代培養時都有一部分主苗長成3~5cm高的成熟種苗，成熟種苗移入 J3固體培養基作生根培養；其余主苗繼續在Jl固體培養基中進行生長培養；
[0009] (4)固體培養基內生根培養：移入J3固體培養基中的成熟種苗作生根培養，培養 條件與步驟3中生長培養條件相同或直接連瓶移入種植大棚苗床上培養，培養35~45天 即可見生出大量根須，此時便可開始煉苗；
[0010] (5)煉苗及種植：將生出大量根須的成熟種苗放置于種植大棚苗床上，每天打開 瓶蓋1~2次，過10~15天后取出，將培養基洗凈，即可進行種植。
[0011] 作為本發明的進一步改進，所述步驟（1)中外植體滅菌的方法為：在超凈工作臺 范圍內，先將沖洗干凈的外植體泡在50% (w/v)乙醇溶液中浸潤5秒，然后迅速撈出，放在 0. 1% (w/v)升汞溶液中浸泡12分鐘，最后用無菌水沖洗至少3遍后，控干水分。
[0012] 作為本發明的進一步改進，所述步驟（1)和（3)中Jl固體培養基的組成及含量 為：1/2MS大量元素，全量MS鐵鹽，全量MS微量元素，全量MS有機類常規，6-節氨基噪呤 4mg/L，6-糠氨基嘌呤0. 2mg/L，蔗糖25g/L，麥芽糖5g/L，瓊脂粉3g/L，PH值5. 8,常規滅菌。
[0013] 作為本發明的進一步改進，所述步驟（2)中J2液體培養基的組成及含量為：1/2MS 大量元素，全量MS鐵鹽，全量MS微量元素，全量MS有機類常規，6-節氨基噪呤4mg/L，6-糠 氨基嘌呤0. 2mg/L，蔗糖25g/L，麥芽糖5g/L，PH值5. 8,常規滅菌。
[0014] 作為本發明的進一步改進，所述步驟（4)中J3固體培養基的組成及含量為：1/2MS 大量元素，全量MS鐵鹽，全量MS微量元素，全量MS有機類常規，萘乙酸5mg/L，6-芐氨基嘌 呤2. 5mg/L，6-糠氨基嘌呤0· 2mg/L，蔗糖25g/L，麥芽糖5g/L，瓊脂4g/L，PH值5. 8,常規滅 菌。
[0015] 作為本發明的進一步改進，所述步驟（1)中的堿性清潔劑包括洗衣粉。
[0016] 本發明中，所述的1/2MS大量元素是指該培養基中的MS大量元素用量是全量MS 大量元素的1/2量，全量MS大量元素的成分見表1。
[0017] 表1 :全量MS大量元素組成及含量
[0018]
[0019] 本發明中，所述的全量MS鐵鹽的成分見表2。
[0020] 表2 :全量MS鐵鹽組成及含量 [0021]
[0022] 本i；明中，所述的全量"微量元素的成分見" 3。 '
[0023] 表3 :全量MS微量元素組成及含量
[0024]
[0025] 本發明中，所述的全量MS有機類常
規的成分見表4。
[0026] 表4 :全量MS有機類常規組成及含量
[0027]
[0028] 本發明與現有技術相比，具有如下優點：
[0029] (1)本發明采用MS大量元素和MS微量元素作用于培養物的礦物營養；糖作為植 物細胞的碳源，提供建成纖維素的來源，同時對培養基形成一定的滲透壓，以便培養物啟動 生長；6-芐氨基嘌呤（6-BA)作為細胞分裂素，促進植株分裂出新的芽；萘乙酸（NAA)作為 誘導素與6-芐氨基嘌呤搭配使用；6-糠氨基嘌呤（KT)作為激動素，防止植株玻璃化。
[0030] (2)本發明的擴繁方法步驟簡單，生產周期與傳統工藝相比大幅減短，成本也降 低，對環境友好，無污染，適合工業化生產，既能夠大幅度提高金線蓮的種苗培育效率（擴 繁效率可以達到傳統方法的3~5倍以上），在一定程度上解決了金線蓮種苗資源短缺的問 題，又可以提高整個市場金線蓮產品的質量。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例進一步闡明本發明的實施過程。
[0032] 實施例1
[0033] 金線蓮種苗的擴繁方法，按以下步驟進行：
[0034] (1)外植體的培養和接種：
[0035] (I. 1)外植體采集及清洗：挑選高度為7~10cm、帶有4~6片葉、具有3~4節 間的成年金線蓮原種植株，在連續三個太陽照射之后的晴天，采集整株植株作為外植體，先 將外植體放在1000 ml的燒杯里，放入少量洗衣粉進行清洗，然后再用清水反復沖洗至無泡 沫為止；
[0036] (1. 2)外植體滅菌：準備50% (w/v)乙醇溶液，0· 1 % (w/v)升汞溶液和無菌水，在 超凈工作臺范圍內，先將沖洗干凈的外植體泡在50% (w/v)乙醇溶液中浸潤5秒，然后迅速 撈出，放在0. 1 % (w/v)升汞溶液中浸泡12分鐘，最后在無菌的容器中用無菌水反復沖洗3 遍后，控干水分，滅菌完成；
[0037] (1. 3)配制Jl液體培養基：取1/2MS大量元素，全量MS鐵鹽，全量MS微量元素， 全量MS有機類常規，6-芐氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0. 2mg/L，蔗糖25g/L，麥芽糖5g/ L，瓊脂粉3g/L，配比后放入搪瓷鍋加熱，不斷攪拌至糖和淀粉完全溶解，再繼續沸騰5分鐘 后，調PH值5. 8 ;然后將Jl液體培養基分裝到事先滅菌好的240ml玻璃組培瓶中，每瓶約 50ml左右，進彳丁常規的尚溫尚壓滅囷；
[0038] (1. 4)外植體接種：將滅菌好的外植體置于接種盤中，無菌切去葉片、頂芽和根 須，切1~2節間為一段，按每瓶1~2段接種到Jl固體培養基中，進行誘導休眠芽生長， 誘導培養