福壽螺膽堿酯酶抑制劑、制備方法及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于殺螺劑的技術領域，更具體的說，本發明涉及一種福壽螺膽堿酯酶抑 制劑、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 福壽螺（Pomacea canaliculata)是近些年來備受國際關注的危害性外來入侵動 物，軟體動物門腹足綱前鰓亞綱腹足目瓶螺科瓶螺屬，原產南美洲亞馬遜河流域。福壽螺對 環境適應性強、食性雜、個體大、生長迅速、繁殖力強，是危害生物多樣性、農業生產和人類 健康的世界性惡性入侵水生動物，在2000年，世界自然保護聯盟外來入侵物種專家委員會 將其列為世界100種惡性外來入侵物種之一。2003年3月，國家環保總局將福壽螺列入首 批入侵我國的16種"危害最大的外來物種"之一。目前，我國對螺害的控制以化學殺螺劑 防治為主，在一定程度為農業的發展發揮了巨大作用，但是隨著農業的發展，殺螺劑的使用 越來越廣泛，再加上不合理利用殺螺劑，造成了環境污染，給生物的生存帶來了威脅。因此 尋找開發可持續的、環境友好的植物來源的殺螺劑，越來越受到研究者們的重視。
[0003] 膽堿酯酶已成為殺蟲劑開發研究的重要靶酶，膽堿酯酶主要存在于動物神經系統 中的一種水解酶，它的作用是水解膽堿能神經末梢釋放的神經介質乙酰膽堿。如果膽堿酯 酶的作用被抑制，就會發生乙酰膽堿過剩而集聚現象，引起膽堿能神經過度興奮、類似有機 磷中毒的癥狀。膽堿酯酶抑制劑的使用能夠抑制福壽螺膽堿酯酶的活性，突觸后神經纖維 長期處于興奮狀態，同時突觸部位的正常神經沖動傳導受阻塞，導致福壽螺中毒死亡，已成 為螺害防治的重要途徑。
【發明內容】
[0004] 為了解決現有技術存在的上述技術問題，本發明的目的在于提供一種福壽螺膽堿 酯酶抑制劑、制備方法及其用途。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明采用了以下技術方案：
[0006] -種福壽螺膽堿酯酶抑制劑的制備方法，其特征在于：以薇甘菊的葉、五爪金龍的 莖，或薇甘菊與南美蟛蜞菊的葉為原料，以乙醇水溶液為溶劑利用超聲波提取工藝得到。
[0007] 其中，所述乙醇為75~95wt%的乙醇水溶液；原料與乙醇水溶液的質量體積比為 Ig ； 3ml ~Ig ； IOml〇
[0008] 其中，超聲波提取的時間為20~60min，提取溫度為0~30°C。
[0009] 其中，超聲波提取后過濾得到提取液，然后蒸發濃縮形成浸膏。
[0010] 本發明的第二方面，還涉及一種福壽螺膽堿酯酶抑制劑。
[0011] 本發明所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑，其特征在于：以薇甘菊的葉或五爪金龍的 莖為原料，以乙醇水溶液為溶劑利用超聲波提取、并經過過濾、蒸發濃縮得到。
[0012] 其中，所述抑制劑為膏劑。
[0013] 其中，所述抑制劑為水溶液。
[0014] 本發明的第三方面，還涉及上述福壽螺膽堿酯酶抑制劑的用途，其特征在于：用于 福壽螺的殺滅。
[0015] 其中，所述福壽螺膽堿酯酶抑制劑的濃度為0. 1~0. 5mg/ml，優選為0. 1~ 0· 2mg/ml 〇
[0016] 本發明所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑具有以下有益效果：
[0017] 當質量濃度為0. lmg/ml以上時，對福壽螺膽堿酯酶的抑制率接近陽性對照組的 抑制率，證明其對福壽螺兩種膽堿酯酶的活性具有較強的抑制作用，說明了這兩種入侵植 物具有開發為福壽螺植物源殺螺劑的潛力。
【具體實施方式】
[0018] 以下將結合具體實施例對本發明所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑、制備方法及其用 途做進一步的說明，以幫助本領域的技術人員對本發明的發明構思、技術方案有更完整、準 確和深入的理解。
[0019] 實施例
[0020] 1. 1動物材料
[0021] 福壽螺成螺采自廣東省潮州市湘橋區社光村田間水溝，采集后洗凈敲去殼，取斧 足組織。
[0022] 1. 2植物材料
[0023] 薇甘菊、南美蟛蜞菊和五爪金龍均采集于韓由師范學院校內。經清洗后自然晾干， 分離出莖和葉，剪成段，分別放入干燥箱，60°C干燥至恒重后磨碎，置于干燥處保存備用。
[0024] 1. 3入侵植物乙醇提取物的制備
[0025] 取每種磨碎的植物樣品20g，用95%乙醇100mL浸泡，超聲波提取30min，過濾得到 提取液后，放進60°C干燥箱蒸發濃縮成浸膏。稱取適量的浸膏，用超純水配制成0. 1、0. 05、 0. 025、0. 0125mg/ml的提取物溶液，4°C冰箱中保存備用。
[0026] L 4酶液的制備
[0027] 用手術刀將其斧足組織切碎，PBS清洗后放入離心管中，按質量體積比1/10 (g/ ml)加入裂解緩沖液（IOmmol · L 1HEPES, ρΗ7· 5, Immol · L 1EDTA, Immol · L 1EGTA, 500mmol · L 1NaCLO. 5 % Triton X-100,10 μ g/ml leupeptin, 20 μ mol · L 1Pepstatin, and 2.5m mol .Libenzamidine HC1)后，4 °C 勾衆，12000rpm 30s，間隔 30s，重復 2 次， 4°C 1600rpm離心10min，轉移上清液至新的離心管中，12000rpm 4°C離心20min，取上清 液，-20 °C冰箱中保存備用。
[0028] 1. 5膽堿酯酶活性的測定及抑制率的計算
[0029] 采用改進的Ellman方法（Ellman et al.，1961)在96孔酶標板上測定樣品的AChE 和BChE抑制活性。具體操作如下：
[0030] 樣品孔：在96孔酶標板中依次加入155 μ L PBS(0.2mol .L SpH= 7.5)，20 μ L待 測樣品溶液，5 μ L酶液。4°C孵育20min后，加10 μ L DTNB (12. 5mmol .L 3，室溫靜置30min， 加入10 μ L底物溶液（12. 5mmol .L 1ATCH或BTCH)。37°C孵育30min后，用酶標儀在405nm 下測定其吸光度值。
[0031] 樣品本底對照孔：用5 μ L PBS代替5 μ L酶液，其它條件不變。
[0032] 陰性對照孔：用20 μ L PBS代替20 μ L待測樣品溶液，其它條件不變。
[0033] 陽性對照孔：用20 μ L BW284c51或iso-OMPA (2mmol .L 3代替20 μ L待測樣品溶 液，其它條件不變。實驗結果如表1和表2所示。
[0034] 表1不同提取物對福壽螺AChE活性的抑制效果
[0036] 陽性對照組（0· Immol · L 4^28^51)抑制率：90· 21 ±5. 89%
[0037] 表1中，薇甘菊+南美蟛蜞菊的復配中，薇甘菊與南美蟛蜞菊的質量比為1 : 1，且 對于該復配物，其中的濃度為二者的總濃度。
[0038] 表2不同提取物對福壽螺BChE活性的抑制效果
[0040] 陽性對照組（0· Immol · L Hso-OMPA)抑制率：92· 67±7. 66%
[0041] 表2中，薇甘菊+南美蟛蜞菊的復配中，薇甘菊與南美蟛蜞菊的質量比為1 : 1，且 對于該復配物，其中的濃度為二者的總濃度。
[0042] 酶活性分析結果顯示薇甘菊和五爪金龍的乙醇提取物對福壽螺AChE活性均具 有較強的抑制作用，而薇甘菊與南美蟛蜞菊的復配能產生更優的復配效果（表1)。不同 植物提取物對福壽螺AChE的抑制強度不同，五爪金龍和薇甘菊比南美蟛蜞菊的抑制作用 較強。同種植物不同部位的乙醇提取物對福壽螺AChE的抑制強度也不同，薇甘菊和南美 蟛蜞菊的葉提取物均比莖提取物的抑制作用強，五爪金龍的莖提取物的抑制作用則比葉 提取物強；在供試質量濃度為0. lmg/ml時，五爪金龍的莖和薇甘菊的葉提取物對福壽螺 AChE的抑制作用最強，抑制率分別為78. 96±3. 32%和77. 83±4. 27%，接近于陽性對照 組的抑制率（90. 21±5. 89% )，其后依次為南美蟛蜞菊的葉和薇甘菊的莖，抑制率分別為 65. 38±8. 95%和58. 65±9. 21%，抑制率低于50%的為南美蟛蜞菊的莖和五爪金龍的葉。 同種植物同個部位的提取物對福壽螺AChE的抑制作用具有濃度依賴性特點，濃度越大抑 制作用越強，隨著濃度的降低，其抑制作用也隨著減弱。
[0043] 由表2可以看出，薇甘菊和五爪金龍的乙醇提取物對福壽螺BChE活性均具有較強 的抑制作用。不同植物提取物對福壽螺BChE的抑制強度不同，五爪金龍和薇甘菊比南美 蟛蜞菊的抑制作用較強，而薇甘菊與南美蟛蜞菊的復配能產生更優的復配效果（表2)。同 種植物不同部位的乙醇提取物對福壽螺BChE的抑制強度也不同，薇甘菊和南美蟛蜞菊的 葉提取物均比莖提取物的抑制作用強，五爪金龍的莖提取物的抑制作用則比葉提取物強； 在供試質量濃度為〇. lmg/ml時，五爪金龍的莖和薇甘菊的葉提取物對福壽螺BChE的抑制 作用最強，抑制率分別為86. 69±8. 96%和82. 86±7. 19%，接近于陽性對照組的抑制率 (92. 67±7. 66% )，其后依次為薇甘菊的莖、五爪金龍的葉和南美蟛蜞菊的葉，抑制率分別 為 65. 38±8· 95%、59· 47±8· 33%和 58. 65±9· 21%。
[0044] 在本發明中，所述的對于本領域的普通技術人員而言，具體實施例只是對本發明 進行了示例性描述，顯然本發明具體實現并不受上述方式的限制，只要采用了本發明的方 法構思和技術方案進行的各種非實質性的改進，或未經改進將本發明的構思和技術方案直 接應用于其它場合的，均在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種福壽螺膽堿酯酶抑制劑的制備方法，其特征在于：以薇甘菊的葉、五爪金龍的 莖，或薇甘菊與南美蟛蜞菊的葉為原料，以乙醇水溶液為溶劑利用超聲波提取工藝得到。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述乙醇水溶液為75~95wt%的乙 醇水溶液；原料與乙醇水溶液的質量體積比為Ig : 3ml~Ig : 10ml。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：超聲波提取的時間為20~60min，提 取溫度為〇~30°C。4. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：超聲波提取后過濾得到提取液，然后 蒸發濃縮形成浸膏。5. -種福壽螺膽堿酯酶抑制劑，其特征在于：以薇甘菊的葉或五爪金龍的莖為原料， 以乙醇水溶液為溶劑利用超聲波提取、并經過過濾、蒸發濃縮得到。6. 根據權利要求1所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑，其特征在于：所述抑制劑為膏劑。7. 根據權利要求1所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑，其特征在于：所述抑制劑為水溶液。8. 權利要求5所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑的用途，其特征在于：用于福壽螺的殺滅。9. 權利要求8所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑的用途，其特征在于：所述福壽螺膽堿酯 酶抑制劑的濃度為〇. 1~〇. 5mg/ml。
【專利摘要】本發明涉及一種福壽螺膽堿酯酶抑制劑、制備方法及其用途，屬于殺螺劑的技術領域。本發明所述的福壽螺膽堿酯酶抑制劑，是以薇甘菊的葉、五爪金龍的莖，或薇甘菊與南美蟛蜞菊的葉為原料，以乙醇水溶液為溶劑利用超聲波提取、并經過過濾、蒸發濃縮得到。當質量濃度為0.1mg/ml以上時，對福壽螺膽堿酯酶的抑制率接近陽性對照組的抑制率，證明其對福壽螺兩種膽堿酯酶的活性具有較強的抑制作用，說明了這兩種入侵植物具有開發為福壽螺植物源殺螺劑的潛力。
【IPC分類】A01P9/00, A01N65/12
【公開號】CN104996474
【申請號】CN201510419790
【發明人】鄒湘輝, 謝東, 吳麗娜, 查廣才, 孫延杰
【申請人】韓山師范學院
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月16日