一種波葉紅果樹組織培養快繁方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物組織培養中種苗快速繁殖方法，具體地說，涉及一種波葉紅果樹組織培養快繁方法。
【背景技術】
[0002]波葉紅果樹波葉紅果樹(davidiana var.undulata )，是薔薇科紅果樹屬的常綠矮小灌木，野生分布于浙江、江西、湖北、湖南、廣西、四川、貴州、云南、陜西等地。是我國園林中常用的觀賞灌木樹種，其初夏花繁色白，秋季葉色朱紅，紅葉期持續達一個月之久，紅果累累，果實經冬不凋，起到豐富園林、美化環境等作用。
[0003]目前波葉紅果樹主要采用種子方式進行繁殖，存在繁殖系數低、周期長、效率低等問題。而植物組織培養技術具有加速育種進程、縮短繁殖時間、改良植物品質、節省空間、減少勞動、可終年生產、不受自然條件限制等特點，可有效解決波葉紅果樹自然繁殖能力差、種子繁殖耗時長的問題。因此建立波葉紅果樹組織離體培養技術體系，提高其繁殖系數，為今后開發利用波葉紅果樹奠定基礎，為實現大規模生產提供技術支持。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供出一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，本發明以波葉紅果樹葉片為外植體，經過愈傷組織誘導、增殖、分化、煉苗移栽等過程建立了波葉紅果樹組織培養的技術體系，達到提高波葉紅果樹的增殖系數，從而實現了本發明的目的。
[0005]本發明的一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:選取健康波葉紅果樹植株的葉片，先用洗潔精水溶液漂洗I?5min,再于自來水沖洗5?lOmin，擦干表面水分后在超凈工作臺中以70%?80%乙醇浸泡5?1s, 0.1%升汞溶液消毒I?lOmin，再用無菌水清洗3?5次后無菌濾紙擦干后備用。
[0006](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)處理后的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊接種誘導培養基上進行愈傷組織誘導。接種后置于每天光照12?15小時，光照強度為1000?15001x,培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成愈傷組織，接種25天后觀察愈傷組織誘導情況并統計愈傷組織誘導率。
[0007](3)增殖培養:將步驟(2)形成的愈傷組織轉接于增殖培養基中進行繼代培養。接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為2000?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養，20?25天轉接一次。
[0008](4)分化培養:將步驟(I)或(2)形成的愈傷組織轉接于分化培養基中進行不定芽誘導培養。接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為2000?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成不定芽和不定根。
[0009](5)煉苗移栽:待幼苗長至健壯后置于自然光照下煉苗5?7天后，洗凈根部培養基，移栽由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，置于光照培養箱內培養，每天以1/2MS大量元素營養液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+0.5?2mg/L TDZ+1?3mg/L2，4-D+0.01 ?lmg/L La (N03)2+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養基為:MS+0.1?lmg/L ΚΤ+0.1?lmg/L2，4-D+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的分化培養基為:MS+1?5mg/L 6-BA+0.5?2mg/L2，4-D+0.1 ?lmg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0013]與現有技術相比本發明的優點是:本發明通過植物組織培養技術短時間內獲得大量優質波葉紅果樹種苗的育種方法。以波葉紅果樹葉片為外植體，經過愈傷組織誘導、增殖、分化、煉苗移栽等過程建立了波葉紅果樹組織培養的技術體系，達到提高波葉紅果樹的增殖系數，為今后開發利用波葉紅果樹奠定基礎，為實現大規模生產提供技術支持。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0015]實施例1:
(I)外植體消毒:選取健康波葉紅果樹植株的葉片，先用洗潔精水溶液漂洗lmin，再于自來水沖洗5min，擦干表面水分后在超凈工作臺中以75%乙醇浸泡5s，0.1%升汞溶液消毒lmin,再用無菌水清洗3次后無菌濾紙擦干后備用。
[0016](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)處理后的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊接種誘導培養基上進行愈傷組織誘導。接種后置于每天光照12小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，培養溫度為25°C的條件下培養20天即可形成愈傷組織，愈傷組織誘導達67.4%。所述的誘導培養基為MS+0.7mg/L TDZ+lmg/L 2，4-D+0.5mg/L La(N03)2+2.0%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0017](3)增殖培養:將步驟(2)形成的愈傷組織轉接于增殖培養基中進行繼代培養。接種后先在25°C條件下全暗培養5天，然后置于每天光照11小時，光照強度為20001χ，培養溫度為25°C的條件下培養，20天轉接一次，增殖系數為5.1。所述增殖培養基為MS+0.4mg/L KT+0.8mg/L 2，4-D+2.0% 糖 +0.5% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0018](4)分化培養:將步驟(I)或(2)形成的愈傷組織轉接于分化培養基中進行不定芽誘導培養。接種后先在25°C條件下全暗培養4天，然后置于每天光照10小時，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的條件下培養14天即可形成不定芽和不定根。所述分化培養基為MS+2mg/L 6-BA+0.8mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA+2.0% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0019](5)煉苗移栽:待幼苗長至健壯后置于自然光照下煉苗5天后，洗凈根部培養基，移栽由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，置于光照培養箱內培養，每天以1/2MS大量元素營養液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率達83.7%。
[0020]實施例2:
(I)外植體消毒:選取健康波葉紅果樹植株的葉片，先用洗潔精水溶液漂洗2min，再于自來水沖洗5min，擦干表面水分后在超凈工作臺中以76%乙醇浸泡7s，0.1%升汞溶液消毒3min,再用無菌水清洗3次后無菌濾紙擦干后備用。
[0021](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)處理后的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊接種誘導培養基上進行愈傷組織誘導。接種后置于每天光照12小時，光照強度為15001x，培養溫度為28°C的條件下培養20天即可形成愈傷組織，愈傷組織誘導達75.8%。所述的誘導培養基為 MS+0.9mg/L TDZ+1.5mg/L 2，4-D+lmg/L La (N03)2+2.0% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH值為5.8。
[0022](3)增殖培養:將步驟(2)形成的愈傷組織轉接于增殖培養基中進行繼代培養。接種后先在28°C條件下全暗培養5天，然后置于每天光照12小時，光照強度為25001x，培養溫度為28°C的條件下培養，23天轉接一次，增殖系數為4.8。所述增殖培養基為MS+0.8mg/L KT+lmg/L 2，4-D+2.0% 糖 +0.5% 瓊脂 +0.07% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0023](4)分化培養:將步驟(I)或(2)形成的愈傷組織轉接于分化培養基中進行不定芽誘導培養。接種后先在28°C條件下全暗培養6天，然后置于每天光照12小時，光照強度為25001x，培養溫度為25°C的條件下培養18天即可形成不定芽和不定根。所述分化培養基為MS+2.5mg/L 6-BA+lmg/L 2，4-D+lmg/L NAA+2.0% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為
5.8。
[0024](5)煉苗移栽:待幼苗長至健壯后置于自然光照下煉苗7天后，洗凈根部培養基，移栽由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，置于光照培養箱內培養，每天以1/2MS大量元素營養液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率達90.1%。
【主權項】
1.一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體消毒:選取健康波葉紅果樹植株的葉片，先用洗潔精水溶液漂洗I?5min,再于自來水沖洗5?lOmin，擦干表面水分后在超凈工作臺中以70%?80%乙醇浸泡5?1s, 0.1%升汞溶液消毒I?lOmin，再用無菌水清洗3?5次后無菌濾紙擦干后備用； (2)愈傷組織誘導:將步驟(I)處理后的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊接種誘導培養基上進行愈傷組織誘導，接種后置于每天光照12?15小時，光照強度為1000?15001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成愈傷組織，接種25天后觀察愈傷組織誘導情況并統計愈傷組織誘導率； (3)增殖培養:將步驟(2)形成的愈傷組織轉接于增殖培養基中進行繼代培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為2000?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養，20?25天轉接一次； (4)分化培養:將步驟(I)或(2)形成的愈傷組織轉接于分化培養基中進行不定芽誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為2000?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成不定芽和不定根； (5)煉苗移栽:待幼苗長至健壯后置于自然光照下煉苗5?7天后，洗凈根部培養基，移栽由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，置于光照培養箱內培養，每天以1/2MS大量元素營養液給幼苗澆水，保持濕度，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根據權利要求1所述的一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+0.5 ?2mg/L TDZ+1 ?3mg/L 2，4-D+0.01 ?lmg/L La (Ν03)2+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
3.根據權利要求1所述的一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養基為:MS+0.1 ?lmg/L ΚΤ+0.1 ?lmg/L 2，4-D+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
4.根據權利要求1所述的一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，其特征在于步驟(4)所述的分化培養基為:MS+1 ?5mg/L 6-BA+0.5 ?2mg/L 2，4-D+0.1 ?lmg/L NAA+2.0% ?.3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
【專利摘要】本發明公開了一種波葉紅果樹組織培養快繁方法，涉及波葉紅果樹（Stranvaesia davidiana var.undulata ）通過植物組織培養技術短時間內獲得大量優質波葉紅果樹種苗的育種方法。本發明以波葉紅果樹葉片為外植體，經過愈傷組織誘導、增殖、分化、煉苗移栽等過程建立了波葉紅果樹組織培養的技術體系，達到提高波葉紅果樹的增殖系數，為今后開發利用波葉紅果樹奠定基礎，為實現大規模生產提供技術支持。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686333
【申請號】CN201510085923
【發明人】劉木嬌
【申請人】劉木嬌
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月22日