一種降低俄羅斯橡膠草組織培養褐化率的組培繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物細胞工程技術植物組織培養領域，具體涉及的是一種降低俄羅斯橡膠草組織培養褐化率的組培繁殖方法。
【背景技術】
[0002]橡膠草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)是菊科蒲公英屬多年生宿根草本植物，其根中天然橡膠含量平均為22.4%，并且其質量與巴西橡膠樹產的橡膠相似，同時還含有25 - 40%的菊糖，被公認為是有發展潛力的優良天然橡膠植物之一，同時也是研宄調控橡膠合成與貯藏分子過程的理想模式植物。
[0003]橡膠草繁殖過程中，自交不育，所以其種子是個體間及不同品系之間雜交的結果，這樣難以用種子保存優良個體及遺傳品系以便進一步育種；同時由于橡膠草野生生境受到嚴重破壞，目前其資源量非常稀少，限制了其試驗研宄，所以需要開發組織培養的方法，同時也為橡膠草遺傳轉化體系的建立及其育種提供技術支持。目前我國的研宄有:中國熱帶農業科學院橡膠研宄所林伯煌《熱帶農業工程》中發表的“橡膠草的組織培養研宄”和石河子大學羅成華《北方園藝》發表的“橡膠草高頻再生體系的建立”等，根據目前的研宄成果分析，現有的技術大多是以新疆野生的橡膠草為材料，然而與橡膠含量更高的俄羅斯橡膠草相比，上述研宄直接以俄羅斯橡膠草為客體，發現俄羅斯橡膠草葉片外植體經直接消毒后接種至培養基上極易導致褐化，尤其在我國大陸的亞熱帶和溫帶氣候及土壤環境下，褐化率竟高達80 %，同時在我國的生長率和成活率也較低。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種降低俄羅斯橡膠草組織培養褐化率的組培繁殖方法。
[0005]本發明的目的是這樣實現的:
[0006](I)接種:選俄羅斯橡膠草品系的成熟種子，消毒處理后在無菌條件下接種于誘導培養基上培養，在接種初期在人工氣候箱中暗培養5天，再移至培養間中自然光下培養，所述的誘導培養基為:MS+6-BAl.5?2.0mg/L+NAA0.1?0.2mg/L ；
[0007](2)誘導分化愈傷組織:將經步驟(I)處理得到的種子萌發后誘導愈傷組織形成，接種于分化培養基上，進行不定芽的分化培養，所述的分化培養基為:MS+6-BA 0.5?
1.0mg/L+NAA 0.05 ?0.lmg/L+GA30.1 ?0.2mg/L ；
[0008](3)不定芽增殖:將步驟(2)的不定芽接種于增殖培養基上進行增殖培養，在增殖培養基中添加抗氧化劑，生成叢生芽，所述的增殖培養基為:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.lmg/L ；
[0009](4)生根培養:將叢生芽分成單株后轉至生根培養基上進行生根培養，生成生根苗，所述的生根培養基為:1/2MS+NAA 0.3mg/L ；
[0010](5)煉苗移栽:將生根苗在煉苗室開蓋鍛煉3?5天后，移栽至細沙、蛭石、珍珠巖等比例混合的基質中，得到橡膠草再生植株。
[0011]所有培養基均添加蔗糖30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值為5.8?6.0。
[0012]在所述的增殖培養基還加入Na2S2O3，含量為15g/L。
[0013]步驟(I)選用的橡膠草品系的成熟種子為外植體材料，首先浸泡4小時，用洗潔精溶液洗凈后，用流水沖2?4小時，在超凈工作臺上，用75%體積百分比酒精消毒10s，用0.1%質量百分比HgCL2溶液消毒5min，最后用無菌水沖洗5?6次，接種于誘導培養基上培養，在接種初期在人工氣候箱中暗培養5天，再移至培養間中自然光下培養。
[0014]步驟(2)中愈傷組織置于分化培養基上培養，4周后愈傷組織分化形成不定芽。
[0015]所述步驟(I)的培養條件是，人工氣候箱中暗培養5d，培養溫度為23±2°C，再移至培養間中自然光下培養，培養溫度為25±2°C，光照強度為1500?20001x，光照時間為16小時/天。
[0016]所述步驟(2)、(3)、(4)的培養條件是，培養溫度為25±2°C、光照強度為1500?20001x、光照時間為16小時/天。
[0017]所述步驟(5)的培養條件是，培養溫度為24-26°C，煉苗室中4遮光，使光照強度為自然光的60 %，濕度控制在80 %。
[0018]本發明的有益效果在于:本發明建立了一種有效降低俄羅斯橡膠草組織培養褐化率與快速繁殖的方法，相比傳統的橡膠草組培繁殖方法，通過調整各階段培養基的成分并添加了抗氧化劑等技術手段極大地降低了俄羅斯橡膠草組織培養褐化率，提高了橡膠草的繁殖系數，經過試驗研宄，使用本發明的培養基可以將褐化率降低到35%以下，添加本發明所述的Na2S2O3能夠將褐化率進一步降低到10%以下。因此本發明能夠在較短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優質壯苗，一致性強，成苗容易，易于管理。擺脫了季節與氣候的限制因素，從而縮短了育苗周期，增加了繁殖量。解決了橡膠草個體間及種間容易雜交而難以保存優良個體及遺傳品系的問題，同時也為橡膠草遺傳轉化體系的建立與育種提供技術支持。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明的流程圖。
[0020]圖2為本發明為誘導培養基BA含量褐化率變化圖。
[0021]圖3為本發明為誘導培養基NAA含量褐化率變化圖。
[0022]圖4為本發明Na2S2O3^量褐化率變化圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖對本發明做進一步描述:
[0024]如圖1所示，本發明的目的是提供一種有效降低俄羅斯橡膠草組織培養褐化率與快速組培繁殖的方法，該方法操作簡單、可有效降低褐化率，進行快速組培繁殖，可快速生產大量性狀一致的優質種苗，解決種子難以保存優良個體及遺傳品系的問題，同時也為橡膠草遺傳轉化體系的建立奠定技術基礎。
[0025]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種有效降低俄羅斯橡膠草組織培養褐化率與快速組培繁殖的方法，包括如下步驟:
[0026](I)培養基的配制:
[0027]A.誘導培養基:MS+6-BAl.5 ?2.0mg/L+NAA0.1 ?0.2mg/L ；
[0028]B.分化培養基:MS+6-BA 0.5 ?1.0mg/L+NAA 0.05 ?0.lmg/L+GA30.1 ?0.2mg/L ；
[0029]C.增殖培養基:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Na2S203 15g/L ；
[0030]D.生根培養基:1/2MS+NAA 0.3mg/L ；
[0031]其中各階段培養基均添加蔗糖30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值為5.8?6.0 ;
[0032](2)材料與接種:材料為引自俄羅斯的橡膠草品系的成熟種子，將消毒處理后的種子在無菌條件下接種于誘導培養基上培養，在接種初期先在人工氣候箱中暗培養5d，再移至培養間中自然光下培養，可有效降低外植體誘導的褐化率至35%以下；
[0033](3)愈傷組織的誘導分化:將步驟(2)種子萌發后誘導愈傷組織形成后接種于分化培養基上，進行不定芽的分化培養；
[0034](4)不定芽的增殖:將步驟(3)的不定芽接種于增殖培養基上進行增殖培養，在增殖培養基中添加抗氧化劑Na2S2O3，有效防止了褐化，將褐化率降至10%以下，從而達到快速繁殖的目的；
[0035](5)生根培養:將步驟⑷叢生芽分成單株后轉至生根培養基上進行生根培養。
[0036](6)煉苗移栽:將步驟(5)的生根苗在煉苗室開蓋鍛煉3?5d后，移栽至細沙:蛭石:珍珠巖=I:1:1的基質中，得到橡膠草再生植株。
[0037]在所述步驟(I)中，所述的培養基包括基本培養基和組培各階段培養基的組分具體為:
[0038]A.誘導培養基:MS+6-BAl.5 ?2.0mg/L+NAA0.1 ?0.2mg/L ；
[0039]B.分化培養基:MS+6-BA 0.5 ?1.0mg/L+NAA 0.05 ?0.lmg/L+GA30.1 ?0.2mg/L ；
[0040]C.增殖培養基:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Na2S203 15g/L ；
[0041]D.生根培養基:1/2MS+NAA 0.3mg/L ；
[0042]其中各階段培養基均添加蔗糖30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值為5.8?6.0 ;
[0043]在所述步驟(2)中，選用橡膠草的成熟種子為外植體材料，先浸泡4h，用洗潔精溶液洗凈后，用流水沖2?4h，在超凈工作臺上，先用75% (體積百分比)酒精消毒10s，再用0.1 % (質量百分比)HgCL2溶液消毒5min，最后用無菌水沖洗5?6次，接種于誘導培養基上培養，在接種初期先在人工氣候箱中暗培養5d，再移至培養間中自然光下培養，可有效降低外植體誘導的褐化率至35%以下。如圖2、3所示
[0044]在所述步驟(3)中，種子培養3?4周后陸續萌發，萌發后的幼苗在誘導培養基上培養2?3周后有愈傷組織形成，選取生長狀態好的愈傷組織置于分化培養基上培養，4周后愈傷組織分化形成不定芽。
[0045]在所述步驟(4)中，不定芽接種于增殖培養基上進行繼代增殖培養，在增殖培養基中添加抗氧化劑Na2S2O3，有效防止了褐化，將褐化率降至10%以下，3周后形成叢生芽。如圖4所示。
[0046]在所述步驟(5)中，叢生芽分成單株后轉至生根培養基上進行生根培養，培養2?3周后成為具有根系的壯苗。
[0047]在所述步驟￠)中，將生根苗在煉苗室開蓋鍛煉3?5d后，移栽至細沙:蛭石:珍珠巖=I:1:1的基質中，培養4?5周后得到橡膠草再生植株。
[0048]在所述步驟(2)中，所述的培養條件是，先在人工氣候箱中暗培養5d，培養溫度為23 士 2°C，再移至培養間中自然光下培養，培養溫度為25 士 2 °C，光照強度為1500?20001x，光照時間為16h/d。
[0049]在所述步驟(3)、(4)、(5)中，所述的培養條件是，培養溫度為25 士 2°C、光照強度為1500?20001x、光照時間為16h/do
[0050]在所述步驟￠)中，所述的培養條件是，培養溫度為24-26°C，前一周適當遮光，使光照強度為自然光的60%，濕度控制在80%左右，以后逐漸降低濕度，恢復光照強度，直至將移栽苗置于自然條件下。
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