靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于動物繁殖技術領域，具體涉及一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法。
【背景技術】
[0002]精子的冷凍保存為瀕危靈長類動物遺傳資源的保護及人工飼養繁殖提供了一條有效的途徑。防凍劑是影響精子冷凍存活率的一個極為重要的因素，在靈長類動物精子冷凍中，甘油仍是使用最廣泛的滲透性防凍劑，但是甘油對精子的毒害作用又會使精子喪失運動能力和受精能力。
[0003]近年來，有研究人員報道了用其他滲透性防凍劑代替甘油冷凍保存非靈長類動物的精子并獲得成功，這激起了人們將非甘油的滲透性防凍劑用于靈長類動物精子冷凍研究的興趣。然而，有限的資料表明非甘油的防凍劑對靈長類動物精子冷凍保存的效果很不一致。Feradis等分別用甘油、二甲基亞砜和丙二醇來凍存取自食蟹猴附睪的精子，結果發現二甲基亞砜具有和甘油一樣好的凍存效果，而丙二醇的凍存效果要差得多。與此相反的是，Sadleir對黑猩猩精子所做的冷凍研究表明甘油的凍存效果明顯比二甲基亞砜的好，Gould和Styperek也發現二甲基亞砜對黑猩猩精子冷凍保存的效果不如甘油，而且用二甲基亞砜凍存的黑猩猩精子不能進行體外受精。
[0004]除上述幾種滲透性防凍劑外，乙二醇也被用于羊精子和馬精子冷凍的研究，而且有實驗顯示乙二醇對精子細胞的毒性低于甘油，然而，能否用它代替甘油來凍存靈長類動物精子卻未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對上述現有技術中存在的不足，提供一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法，用毒性較低的乙二醇代替甘油進行靈長類動物精液的超低溫冷凍保存，實現用冷凍復蘇精液成功進行靈長類動物的體外受精或人工授精。
[0006]本發明采取如下技術方案進行:
一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法，通過以下步驟實現:
(1)冷凍保護液的配制
A)、稱取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G鈉鹽、5mg硫酸鏈霉素依次溶于70mLMill1-Q超純水中，再加入1mL卵黃并將其混合均勻，然后加水定容至10mL,于7000g離心Ih去除卵黃顆粒，取上清液用NaOH或HCl調節pH至7.0-7.2，制成冷凍保存稀釋液；
B)取18mL上述稀釋液，加入2mL乙二醇，預冷至4°C，得2X冷凍保護液；
(2)精液冷凍
A)室溫下將靈長類動物精液與上述稀釋液按1: 9的體積比在試管中混合，然后于4°C冰浴降溫2小時；
B)、降溫后的精子試管中緩慢加入等體積、預冷至4°C的2X冷凍保護液，繼續在4°C平衡30分鐘；
C)、平衡結束前，將防凍后的精子分別裝入0.25 mL冷凍麥管并用封口機加熱封口 ；
D)、將封口后的麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氮中冷凍保存；
E)、復蘇時將冷凍麥管由液氮中迅速轉移至37°C的水浴中解凍2分鐘。
[0007]所述步驟(2)中的室溫為20-23°C。
[0008]所述步驟(2)中是將冷凍保護液分五次加入試管，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，乙二醇的終濃度為5% (v/v)0
[0009]本發明的優點是:
本發明采用毒性較低的乙二醇代替甘油進行靈長類動物精液的超低溫冷凍保存，凍存效果與含甘油的防凍劑無顯著差異，為低毒防凍劑的研發提供科學依據。
【具體實施方式】
[0010]以下通過實施例對本發明做進一步描述。
[0011]實施例1:
稱取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G鈉鹽、5mg硫酸鏈霉素依次溶于70mLMill1-Q超純水中，再加入1mL卵黃并將其混合均勻，然后加Mill1-Q超純水定容至10mL,于7000g離心I h去除卵黃顆粒；取上清液用IN NaOH或HCl調節pH至7.0-7.2，制成冷凍保存稀釋液；向稀釋液中加入體積比為10%的乙二醇制成2X防凍液；20-23°C室溫下，將食蟹猴精子與稀釋液按1:9的體積比在試管中混合，然后于4°C冰浴降溫2小時；將等體積、預冷至4°C的2X防凍液緩慢加入降溫后的精子中，繼續在4°C平衡30分鐘；將精子分別裝入0.25 mL冷凍麥管并用封口機加熱封口；將麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氮中保存。
[0012]對冷凍復蘇的精子，分別檢測其精子運動度、質膜完整率和頂體完整率，質膜完整性的檢測采用熒光染料Hoechst 33342 (H342)和碘化丙錠(PI)雙重熒光染色法，精子頂體完整性檢測采用異硫氰酸熒光素標記的花生凝集素(FITC-PNA)熒光染色法進行，結果表明:冷凍復蘇后的精子運動度、質膜完整率及頂體完整率分別為46%、55%和82%。
[0013]實施例2:
稱取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G鈉鹽、5mg硫酸鏈霉素依次溶于70mLMill1-Q超純水中，再加入1mL卵黃并將其混合均勻，然后加Mill1-Q超純水定容至10mL,于7000g離心I h去除卵黃顆粒；取上清液用IN NaOH或HCl調節pH至7.0-7.2，制成冷凍保存稀釋液；向稀釋液中加入體積比為10%的乙二醇制成2X防凍液；20-23°C室溫下將獼猴精子與稀釋液按1:9的體積比在試管中混合，然后于4°C冰浴降溫2小時；降溫后的精子試管中分五次緩慢加入等體積、預冷至4°C的2X防凍液，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，乙二醇的終濃度為5% (v/v)，然后繼續在4°C平衡30分鐘；將防凍后的精子分別裝入0.25 mL冷凍麥管并加熱封口 ；將麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氣中保存。
[0014]對冷凍復蘇的精子，分別檢測其精子運動度、質膜完整率和頂體完整率，質膜完整性和頂體完整性的檢測分別采用熒光染料Hoechst 33258 (H258)和異硫氰酸熒光素標記的花生凝集素(FITC-PNA)熒光染色法進行，結果表明:冷凍復蘇后的精子運動度、質膜完整率及頂體完整率分別為45%、54%和82%。
[0015]上述實例僅僅是為清楚的說明本發明所作的舉例，對于所述領域的普通技術人員來說，由此引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。
【主權項】
1.一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法，其特征在于，步驟如下: (1)冷凍保護液的配制 A)稱取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G鈉鹽和5mg硫酸鏈霉素，依次溶于70mLMill1-Q超純水中，再加入1mL卵黃并混合均勻，然后加水定容至10mL,于7000g離心Ih去除卵黃顆粒，取上清液用NaOH或HCl調節pH至7.0-7.2，制成冷凍保存稀釋液； B)取18mL上述稀釋液，加入2mL乙二醇，預冷至4°C，得2X冷凍保護液； (2)精液冷凍 A)室溫下將靈長類動物精液與上述稀釋液按1: 9的體積比在試管中混合，然后于4°C冰浴降溫2小時； B)降溫后的精子試管中緩慢加入等體積、預冷至4°C的2X冷凍保護液，繼續在4°C平衡30分鐘； C)平衡結束前，將防凍后的精子分別裝入0.25 mL冷凍麥管并用封口機加熱封口 ； D)將封口后的麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氮中冷凍保存； E)復蘇時將冷凍麥管由液氮中迅速轉移至37°C的水浴中解凍2分鐘。
2.根據權利要求1所述的一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的室溫為20~23°C。
3.根據權利要求1所述的一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法，其特征在于，所述步驟(2)中將2X冷凍保護液分五次加入試管，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，乙二醇的終濃度為5% (v/v)0
【專利摘要】本發明公開一種靈長類動物精液無甘油超低溫冷凍保存的方法，本發明采用毒性較低的乙二醇代替甘油進行靈長類動物精液的超低溫冷凍保存，凍存效果與含甘油的防凍劑無顯著差異，為低毒防凍劑，有助于用冷凍復蘇精液進行靈長類動物的體外受精或人工授精。
【IPC分類】A01N1-02
【公開號】CN104521945
【申請號】CN201410847292
【發明人】李亞輝, 楊明華
【申請人】云南農業大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月31日