專利名稱：新型生物防治劑的制作方法
技術領域：
本發明是有關用菌株作為生物防治劑，保護植物或農作物避免病原性真菌感染這一領域。
目前，市場上有一些殺真菌劑。化學殺真菌劑盡管十分有效，但可能會對環境造成不應有的污染，由于大多數種類對人類健康有害，操作時需十分小心，并且這類藥劑對于產生抗性的病原菌株也無效。
與其它防治方法相比，使用生物防治劑或生物殺蟲劑可能更加有效或有益，所以此類制劑已被廣泛試用。已知有些細菌和真菌菌株對各種微生物致病劑的生長有抑制作用。為了達到在田間有效使用的要求，藥劑必須穩定，在田間的使用效果有重復性，并且能夠在田間條件下應用。到目前為止，只有極少數藥劑能達到這些要求而被用作商品。
其中一種產品就是用綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株MA342(NCIMB40616)防治種子植物的真菌疾病(PCT申請WO95/28085，公開于1995年10月26日)。
本項發明還提供了植物疾病防治組合物，其中包含一種生物防治劑作為活性成分，該生物防治劑是上述一種或多種菌株的分離物或其生物純培養物；或者是包括一種或多種上述分離物或其抗病原性活性代謝物的培養液。而且，本項發明還提供了用發明的一種或多種菌株，防治由病原性真菌引起的植物疾病的方法。此外提供了用本發明的生物防治劑，防治由病原性真菌引起的植物疾病的應用。
附圖簡述
圖1表明細菌菌株Ab131，MF416和Ki72對終極腐霉(Pythiumultimum)所致種子和幼苗疾病的作用。
DI＝患病指數(0＝健康，4＝100％感染的根部)圖2表明細菌菌株Ab131，Ki72及殺真菌劑1996年在田間條件下對糖相對產量的影響。殺真菌劑Eup＝抑菌靈(Euparen)(對甲抑菌靈)Tach＝土菌消(Tachigaren，Hymexazol)殺蟲劑Montur＝吡蟲啉+七氟菊酯圖3表明細菌菌株Ki72、Ki353及殺真菌劑1997年在田間條件下對糖相對產量的影響。殺真菌劑Tach.＝土菌消Eup.＝對甲抑菌靈殺蟲劑Montur＝吡蟲啉+七氟菊酯圖4表明菌株Ki353和MF416及殺真菌劑1998年在田間條件下對植物數目的影響。殺真菌劑土菌消 TMTD＝Tiram殺蟲劑Montur＝吡蟲啉+七氟菊酯發明詳述一方面，本項發明涉及一種用于防治由病原性真菌引起的植物疾病的新型生物防治劑，其特征在于是屬于包括假單胞菌屬之種的菌株Ki72、Ab131、Ki353、MF416和Ma358(它們保藏于Aberdeen，Scotland的國立工業及海洋細菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏號分別為40936，40940，40941，40942和41010)的組中的一種或多種菌株的分離物；或者是其生物學純培養物或其與親本菌株具有基本相同特征的突變體。
另一方面，本發明涉及防治由病原性真菌引起的植物疾病的組合物，其特征是含有如上定義的生物防治劑，或含有其抗病原活性代謝物的培養液，或含有這樣的抗病原活性代謝物作為活性成分。
在本發明的一個優選實施方案中，待被保護以免受病原侵襲的植物是甜菜。
病原性真菌優選屬于腐霉屬之種(Pythium sp.)或絲囊霉屬之種(Aphanomyces sp.)的真菌，尤其是終極腐霉。
而且，本發明所涉及的生物防治劑及組合物預計可用于其它象蔬菜等經濟作物(如番茄)，特別是受腐霉屬之種真菌攻擊的作物。
另外，本發明涉及一種防治由病原性真菌引起的植物疾病的方法，包括將有效劑量的抗病原活性生物防治劑導入待抑制疾病的環境中，本方法的特征在于應用上述的生物防治劑或組合物。
本發明的生物防治劑可用于種子、幼苗、植物營養繁殖單位、植株或植株部分或者土壤。
根據本發明又一方面，提供了上述生物防治藥劑或組合物用于防治病原性真菌，特別是腐霉屬之種類真菌引起的植物疾病的用途。
以下是本發明中新細菌菌株的特征，并描述了菌株增殖以及在田間或溫室制劑制備和應用的優選方法。提供一些實例進一步闡明本發明的方法和組合物，但范圍不限于此。
新細菌菌株的特征菌株可以用表1所示生化測試鑒定。
表1各菌株進行API20NE快速測定結果，以下為注釋NO3＝硝酸鹽還原作用 TRP＝吲哚產生GL＝葡萄糖產酸ADH＝精氨酸雙水解酶 URE＝脲酶ESC＝七葉苷水解GEL＝明膠水解 PN＝B-半乳糖苷酶 GLU＝葡萄糖同化ARA＝阿拉伯糖同化 M＝甘露糖同化MAN＝甘露醇同化NAG＝N-乙酰葡糖胺同化 MAL＝麥芽糖同化 GNT＝葡糖酸同化CAP＝癸酸鹽同化 ADI＝己二酸鹽同化MLT＝蘋果酸鹽同化CIT＝檸檬酸鹽同化 PAC＝苯基乙酸鹽同化 OX＝細胞色素氧化酶菌株增殖及制劑制備和在田間或溫室應用的優選方法獲得大量抗病原活性菌株最好通過培養方法進行，該方法包括在包含合適的液體培養基的搖瓶或發酵罐中接種所述菌株的純培養物樣品。菌株也可在無菌表面如瓊脂表面上生長，當菌落長出時，可將細胞重懸于水或本領域公知的其它液體培養基中。培養基在原則上可以是本領域公知的任何細菌生長培養基。發酵培養至足夠的菌體濃度，如達到5-109cfu(菌落形成單位)/ml液體培養基。如此獲得的發酵液或菌懸液即可在植物保護中應用，或者先經過處理或制劑再進行使用。
一種類型的處理中，可以通過例如加熱滅活或者離心處理發酵培養液中的菌體細胞，含有細菌代謝物的培養液或上清，經或不經過預先的純化和/或濃縮，均可用于保護植物。菌體懸液或發酵培養液還可以與本領域公知的一種或幾種化合物或化合物組均勻混合，前提條件是這些化合物與這些細菌菌株、其抗病原活性代謝物或它們的衍生物相容。適合的化合物可以為粉狀添加劑或固體載體，例如滑石、高嶺土、膨潤土、蒙脫石，本領域公知的可濕粉末、碳源營養物質(如葡萄糖、蔗糖和果糖)或者細菌混合營養物(如酵母提取物、細菌蛋白胨和胰蛋白胨)、金屬鹽類、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、離子或非離子表面活性劑、植物營養成分、植物生長調節劑、殺真菌劑、殺蟲劑、殺菌劑等等。在與合適的化合物混合之前或之后，細菌懸浮物和發酵肉湯也可經過干燥或冷凍干燥，獲得的產品可用于植物保護。一種合適的干燥方法是例如將蛭石與細菌發酵液混合，經過空氣干燥。
可以采用已知用細菌菌株處理種子、植物營養繁殖單位、植株和土壤與菌株的任何方法應用菌體和代謝產物制劑。根據預定的目標和主要的環境狀況可選擇使用噴灑、噴霧、撒粉、播散、造粒、浸漬或傾倒。應用的有利比率，對于種子處理一般為1011-1012cfu/ha，噴灑為1012-1014cfu/ha，或相應的細菌代謝物量。
實施例1本發明細菌菌株的分離所挖不同植物物種的根用無菌自來水清洗去除附著的泥土。在無菌條件下，從幼根剪斷下2-3厘米的小段并進行處理。選取的是根尖上方區的一部分。用燒過的解剖刀在根段上切幾個小切口，然后將根段置于TSA10瓊脂(Tryptic Soy Agar Oxoid Ltd.，10g/litre)平板上摩擦。平皿在0℃放置9天，菌落長出后，挑取菌落，在TSA10培養基中5℃培養5天。
實施例2菌株的保藏純培養物用小安瓿管凍存于-70℃，凍存液為經高壓滅菌的10％甘油(用自來水配制，調pH至7.15)。安瓿管在-70℃凍凝后，轉至-20℃。
為了長期保藏，將分離物凍干。在TSA10瓊脂(Tryptic Soy AgarOxoid Ltd.，10g/litre)上生長48小時后，將菌苔從瓊脂表面上刮下，與凍干劑(Dextran T70，Pharmacia Fine Chemicals Ltd.，50g；Na-L-glutamate，Kebo AB，50g；1000ml蒸餾水)混合，注入小安瓿管(20ml)中，在Hetoscicc凍干機(Heto Ltd.，Denmark)中放置24小時，凍干后用橡膠塞密封住安培管口，4℃保藏。
實施例3抗腐霉活性成分的初篩接種物制備從感染的甜菜根部分離終極腐霉，在PDA(Potato DextroseAgar)中培養生長。待瓊脂板中長出真菌后，將其浸解入花盆內(13×12×7cm)，其中盛有2/3體積的混有20％(v/v)沙的市售泥炭混合物(Enhetsjord K Normal)(未經滅菌)。在花盆1cm深的位置種上50粒甜菜種子，花盆置于空調室中，培養條件如下每天17℃光照16小時，14℃黑暗培養8小時。4周后，花盆中的土壤可作為接種物(0.2％w/w)感染土壤，進行初步篩選實驗。
細菌的生產用于甜菜種子的細菌處理如下將在TSA10瓊脂中15℃培養24小時的培養物從直徑9cm的Petri平皿中刮取，與15ml自來水混合，用此混合物噴灑種子。30分鐘后，倒掉多余的混合物，種子過夜干燥。
在初篩中，在置于上述相同條件下的花盆中種植了16粒種子。4周后，對植物計數，并評價根部是否受腐霉的感染。
細菌菌株對腐霉作用的溫室實驗用上述相同條件在空調室進行生物測定。
圖1顯示了對照(種在終極腐霉感染土壤的未經處理的種子)、健康土壤(種在健康土壤中的未處理種子)及用細菌菌株處理的種子三種情況下細菌菌株對病癥的防治作用。
細菌菌株對腐霉作用的田間實驗實例在1996和1997年，細菌菌株Ki72，Ab131用于田間實驗；1998年細菌菌株MF416和Ki353用于田間實驗。通過土壤實驗確定真菌病原體的高負載量。田間實驗是在6個不同區域進行的，在每個區域隨機區組劃分設4個平行組。所有實驗的樣地面積為6行×12米。圖2顯示了對照、細菌菌株+殺蟲劑兩個處理組和兩種不同殺真菌劑+殺蟲劑一個處理組的糖相對產量。
圖3所示為1997年田間實驗中，菌株Ki72和Ki353與殺真菌劑對糖相對產量的影響。
圖4所示為對照、兩種殺真菌劑+殺蟲劑、Ki353、Ki353+殺蟲劑、MF416和MF416+殺蟲劑幾種情況下，菌株Ki353和MF416與殺真菌劑對糖相對產量的影響。
1996、1997、1998年細菌菌株和殺真菌劑田間實驗中對糖相對產量的影響。
1996、1997、1998年細菌菌株和殺真菌劑田間實驗中對糖相對產量的影響如表2所示
*TMTD代替Eup殺真菌劑Eup＝抑菌靈(對甲抑菌靈)，Tach＝土菌消TMTD＝Tiram殺蟲劑Montur＝吡蟲啉+七氟菊酯-＝未測試微生物保藏已根據布達佩斯條約做了如下保藏微生物保藏機構保藏日保藏號Ki72 NCIMB 30March1998 40936Ab131NCIMB 30March1998 40940Ki353NCIMB 30March1998 40941MF416NCIMB 30March1998 40942Ma358NCIMB 10March1999 41010
權利要求
1.用以防治病原性真菌引起的植物疾病的一種新型生物防治劑，其特征在于是屬于包括假單胞菌屬之種的菌株Ki72、Ab131、Ki353、MF416和Ma358(它們保藏于Aberdeen，Scotland的國立工業及海洋細菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏號分別為40936，40940，40941，40942和41010)的組中的一種或多種細菌菌株的分離物；或者是其生物學純培養物或其與親本菌株具基本相同特征的突變體。
2.用于防治由病原性真菌所致植物疾病的組合物，其特征在于包含權利要求1的生物防治劑或者包含含有其抗病原活性代謝物的培養液作為活性成分。
3.根據權利要求2的組合物，其特征在于待保護免受病原性真菌侵染的植物是甜菜。
4.根據權利要求3的組合物，其特征在于所述病原性真菌是屬于腐霉屬之種或絲囊霉屬之種的真菌組的真菌。
5.根據權利要求4的組合物，其特征在于所述病原性真菌是終極腐霉。
6.根據權利要求2-5中任何一項的組合物，其特征在于所述活性成分與農業上可接受的載體或稀釋劑組合物混合在一起。
7.根據權利要求6的組合物，其特征在于所述活性成分與液體載體混合在一起。
8.根據權利要求6的組合物，其特征在于所述活性成分浸漬于固體多孔材料中。
9.根據權利要求6的組合物，其特征在于還包含添加劑作為粘附劑。
10.根據權利要求6的組合物，其特征在于還包含營養源。
11.一種防治由病原性真菌所致植物疾病的方法，包括將有效劑量的抗病原活性生物防治劑導入待抑制該疾病的環境中，其特征在于施用權利要求1的生物防治劑或權利要求2-10中任一項的組合物。
12.根據權利要求11的方法，其特征在于所述生物防治劑或組合物被施加到種子上。
13.根據權利要求11的方法，其特征在于所述生物防治劑或組合物被施加到植物營養繁殖單位上。
14.根據權利要求11的方法，其特征在于所述生物防治劑或組合物被施加到植物上。
15.根據權利要求11的方法，其特征在于所述生物防治劑或組合物被施加到植物在其中生長或待生長的培養介質中。
16.根據權利要求11-15中任一項的方法，其特征在于待保護的植物是甜菜。
17.根據權利要求16的方法，其特征在于導致疾病的病原性真菌屬于腐霉屬之種或絲囊霉屬之種的真菌組。
18.權利要求1的生物防治劑或權利要求2-10中任一項的組合物用于防治由病原性真菌所致植物疾病的用途。
19.根據權利要求18的用途，其特征在于待被保護的植物是甜菜。
20.根據權利要求19的用途，其特征在于所述病原性真菌屬于腐霉屬之種或絲囊霉屬之種的真菌組。
全文摘要
本項發明提供了一種新型有用的生物防治劑,可有效用于防治經濟作物受病原攻擊,其特征在于是屬于包括假單胞菌屬之種的菌株Ki72、Ab131、Ki353、MF416和Ma358(它們保藏于Aberdeen,Scotland的國立工業及海洋細菌保藏有限公司(NCIMB),保藏號分別為40936,40940,40941,40942和41010)的組中的一種或多種菌株的分離物。這些分離物按照布達佩斯公約的規則保藏。本發明還提供了植物疾病防治組合物及用本發明的一種或多種細菌菌株防治病原性真菌所致植物疾病的方法。
文檔編號A01N63/02GK1307449SQ9980789
公開日2001年8月8日 申請日期1999年6月24日 優先權日1998年6月26日
發明者B·戈哈德森, M·厚克博格, C·塞寧 申請人:生物農業股份公司