專利名稱：簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胚胎冷凍解凍方法，特別是用于哺乳動(dòng)物的胚胎冷凍解凍方法，屬胚胎生物技術(shù)領(lǐng)域。
1972年Whittingham等首先利用小鼠2～8細(xì)胞胚胎冷凍保存(傳統(tǒng)冷凍法)成功并移植后獲得后代，他們采用二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide:DMSO)為主體抗凍保護(hù)劑，濃度為1.5Mol/L，使用降溫冷凍儀，以-0.3℃/min的速度降至-30℃～-35℃，然后再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液氮中。冷凍解凍后胚胎成活率為50％～70％，妊娠率為65％，產(chǎn)仔率為48％。該技術(shù)所使用的降溫冷凍儀約4萬(wàn)美元/臺(tái)，費(fèi)用昂貴，且整個(gè)冷凍程序需3小時(shí)，操作時(shí)間長(zhǎng)、效率低，更不適應(yīng)于邊遠(yuǎn)牧區(qū)的胚胎冷凍。
1985年Rall等又發(fā)明了胚胎玻璃化冷凍方法，他們利用DMSO，乙酰胺(Acetamide)丙二醇(Propylene glycol)為主體的抗凍保護(hù)劑，配制成濃度高達(dá)6Mol/L的玻璃化溶液(VS液)，不使用降溫冷凍儀，在室溫下對(duì)小鼠2細(xì)胞、8細(xì)胞和桑椹胚進(jìn)行冷凍保存，該方法需要分三步降溫(22℃下胚胎于25％VS液中平衡15min，4℃下于50％VS液中平衡10min，4℃下于100％VS液中平衡10min)，整個(gè)程序需要35min。該技術(shù)由于所用抗凍保護(hù)劑對(duì)胚胎的化學(xué)毒性較大，冷凍后胚胎的成活率不穩(wěn)定(46％～95％)，產(chǎn)仔率較低(22％～38％)。
本發(fā)明的目的是要提供一種速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單、效率高的胚胎冷凍解凍方法。
為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明者首先對(duì)幾種抗凍保護(hù)劑進(jìn)行篩選，通過(guò)對(duì)胚胎的毒性試驗(yàn)及胚胎細(xì)胞膜的通透性測(cè)定，證明乙二醇(Ethylene glycol:EG)的化學(xué)毒性最小且通透性強(qiáng)，其次是丙三醇(Glycerol:GL)、丙二醇、DMSO、乙酰胺。為此，發(fā)明者以乙二醇(或丙三醇)為主體抗凍保護(hù)劑，添加大分子物質(zhì)聚蔗糖和蔗糖配制成EFS(或GFS)液，其濃度大于7.0Mol/L。為避免其對(duì)胚胎的化學(xué)毒性傷害，冷凍前將胚胎在濃度為10～20％EG(或GL)溶液中預(yù)處理5～10min，再移入EFS(或GFS)溶液中平衡30s～1min后直接投入液氮即二步法冷凍保存。目的是既能使抗凍保護(hù)劑乙二醇(或丙三醇)較為緩和地透入胚胎細(xì)胞內(nèi)部，又能在冷凍的瞬間形成玻璃化狀態(tài)。本方法冷凍保存的小鼠原核胚～孵化囊胚，其成活率均能達(dá)到95％左右，并獲得了較高的移植妊娠率(60～75％)。本方法對(duì)其他家畜如兔、牛和綿羊胚胎的冷凍保存也獲得了基本相同的效果。
本發(fā)明的具體技術(shù)解決方案是(1)配制10％～20％乙二醇(EG)溶液取1～2ml乙二醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成21％～18％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.35Mol/L～0.3Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)濃度的混合液即FS液，然后將FS液與乙二醇相應(yīng)按7∶3～6∶4的比例(V/V)混合后制成EFS30～EFS40玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％～20％EG溶液中預(yù)處理5～10min，然后移入含有EFS玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s鐘解凍后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
上述技術(shù)解決方案中所采用的抗冷凍保護(hù)劑乙二醇(EG)可由丙三醇(GL)代替，則其技術(shù)方案為(1)配制10％～20％丙三醇(GL)溶液取1～2ml丙三醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成30％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.5Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)濃度的混合液即FS液，然后將FS液與丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％～20％GL溶液中預(yù)處理5～l0min，然后移入含有GFS玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s中解凍后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
在上述的技術(shù)解決方案中，其步驟(3)的冷凍過(guò)程中所用的細(xì)管為0.25ml塑料細(xì)管。
下面是本發(fā)明簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法，的兩個(gè)具體事實(shí)例例1(1)配制10％乙二醇(EG)溶液取1ml乙二醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成21％和0.35Mol/L濃度的混合液即FS液，然后將FS液與乙二醇按7∶3的比例(v/v)混合后制成EFS30玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％EG溶液中預(yù)處理5min，然后移入含有EFS30或EFS40即玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s鐘解凍后，用0.5Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
例2(1)配制10％丙三醇(GL)溶液取1ml丙三醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液即FS液，然后將FS液與丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％GL溶液中預(yù)處理5min，然后移入含有GFS50玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s解凍后，用0.5Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)速度快改變傳統(tǒng)冷凍方法的時(shí)間長(zhǎng)、速度慢，即由一個(gè)冷凍程序3h縮短為30s；(2)降低成本、操作簡(jiǎn)單傳統(tǒng)方法中使用降溫冷凍儀(約4萬(wàn)美元/臺(tái))冷凍胚胎，改為室溫(20～25℃)下徒手操作；(3)無(wú)冰晶傳統(tǒng)冷凍方法有冰晶生成，本方法無(wú)冰晶生成，即呈玻璃化狀態(tài)，主要是使用了高分子物質(zhì)聚蔗糖(WF:70,000)，可避免冰晶對(duì)胚胎的物理性損傷；(4)適用范圍廣傳統(tǒng)的方法需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，本方法可在現(xiàn)場(chǎng)操作，特別是在無(wú)電和邊遠(yuǎn)牧區(qū)更為實(shí)用；(5)效率高與傳統(tǒng)的方法相比，本方法用EFS冷凍后胚胎成活率(94％～100％)、移植妊娠率(66％～75％)和產(chǎn)仔率(56％～66％)可提高5％～10％。用GFS冷凍后胚胎成活率為92％，移植妊娠率為60％，產(chǎn)仔率高達(dá)74％。
圖1為本發(fā)明的胚胎玻璃化冷凍方法的實(shí)施例示意圖；圖2為本發(fā)明的胚胎玻璃化解凍方法的實(shí)施例示意圖。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
如
圖1所示，將胚胎于PBS液中洗凈，用巴氏吸管將胚胎移入10％的EG(或GL)液中，在20～25℃室溫下預(yù)處理5min，然后將胚胎移入含有EFS(或GFS)液和蔗糖溶液的0.25ml塑料細(xì)管的EFS(或GFS)液段中平衡30s，用封口粉封口即投入液氮，移入液氮罐中保存。
如圖2所示，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s解凍后，用0.5Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎，并將回收的胚胎移入新鮮0.5Mol/L蔗糖溶液中，再將胚胎移入PBS液中洗凈后培養(yǎng)。以上沖洗、回收、移入步驟在5min內(nèi)完成。
權(quán)利要求
1．一種簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法，其特征在于，其具體技術(shù)解決方案是(1)配制10％～20％乙二醇(EG)溶液取1～2ml乙二醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成21％～18％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.35Mol/L～0.3Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)濃度的混合液即FS液，然后將FS液與乙二醇相應(yīng)按7∶3～6∶4的比例(V/V)混合后制成EFS30～EFS40玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％～20％EG溶液中預(yù)處理5～10min，然后移入含有EFS玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s鐘解凍后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法，其特征在于，其中所采用的抗冷凍保護(hù)劑乙二醇(EG)可由丙三醇(GL)代替，則其技術(shù)方案為(1)配制10％～20％丙三醇(GL)溶液取1～2ml丙三醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成30％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.5Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)濃度的混合液即FS液，然后將FS液與丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％～20％GL溶液中預(yù)處理5～l0min，然后移入含有GFS玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s中解凍后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法，其特征在于，其步驟(3)的冷凍過(guò)程中所用的細(xì)管為0.25ml塑料細(xì)管；
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法，其特征在于，其具體技術(shù)解決方案可以是(1)配制10％乙二醇(EG)溶液取1ml乙二醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成21％和0.35Mol/L濃度的混合液即FS液，然后將FS液與乙二醇按7∶3的比例(v/v)混合后制成EFS30玻璃化溶液。(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％EG溶液中預(yù)處理5min，然后移入含有EFS30即玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約l0s鐘解凍后，用0.5Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法，其特征在于，其具體技術(shù)解決方案可以是(1)配制10％丙三醇(GL)溶液取1ml丙三醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液將聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液即FS液，然后將FS液與丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷凍在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入10％GL溶液中預(yù)處理5min，然后移入含有GFS50玻璃化溶液的細(xì)管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷凍保存；(4)解凍需要解凍時(shí)，將冷凍保存的細(xì)管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，約10s解凍后，用0.5Mol/L蔗糖溶液沖洗管中內(nèi)容物，在顯微鏡下回收胚胎。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種簡(jiǎn)易高效胚胎玻璃化冷凍解凍方法,屬胚胎生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單、效率高。本發(fā)明采用乙二醇(EG)或丙三醇(GL)為主體抗凍保護(hù)劑配制成EFS或GFS玻璃化溶液,濃度大于7.0mol/l,在室溫(20～25℃)下,將胚胎于10～20%EG(或GL)溶液預(yù)處理5～10min,然后移入EFS(或GFS)液中平衡30s～1min后直接投入液氮。本方法冷凍保存的小鼠原核胚～孵化囊胚,其成活率均能達(dá)到95%左右,并獲得了較高的移植妊娠率(60～75%)。本方法對(duì)其他家畜如兔、牛和綿羊胚胎的冷凍保存也獲得了基本相同的效果。
文檔編號(hào)A61D19/02GK1302590SQ9912188
公開(kāi)日2001年7月11日 申請(qǐng)日期1999年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月22日
發(fā)明者朱士恩, 曾申明, 張忠誠(chéng), 田見(jiàn)暉 申請(qǐng)人:朱士恩