專利名稱：：一種獲得治療性克隆植入前胚胎的制備方法
技術領域：
：本發明涉及治療性克隆植入前胚胎的制備方法，更具體地，涉及用體細胞(尤其是人的體細胞)來治療性克隆植入前胚胎的制備方法。所謂治療性克隆，是指應用病人的體細胞移植到去核的卵母細胞內，經過一定的處理使其發育到囊胚，再利用囊胚建立ES細胞(是從早期內細胞團或原始生殖細胞經體外分化抑制培養篩選分離出來的具有全能性和多能性的細胞)，在體外進行誘導分化成特定的組織或器官(如皮膚、軟骨、乳房、腎臟、心、牙齒、心臟、肝臟、尿道、膀胱等等)，再將組織或器官移植到病人身上。利用這種方法解決組織或器官移植過程中最重要的排斥反應，而且解決了組織或器官的來源問題。然而，治療性克隆的獲得涉及到多種較為復雜的技術。哺乳動物細胞核移植，不僅在胚胎生物學研究中是一種很重要的工具，而且對“優良”胚胎(家畜)的擴繁也是一種較好的方法。在哺乳動物中，已應用早期的胚胎分裂球或胚胎來源的培養細胞(胚胎干細胞，簡稱為“ES細胞”)來提供細胞核，獲得了相應的克隆動物綿羊(使用8-16細胞)[WilladsenS.M.,etal,Nature,1986]；兔(使用8-細胞)[SticeS.L.,etal,Bio.Reprod.,1989]；豬(使用2-8細胞)[PratherR.S.,etal.Biol.Reprod.,1989]；牛(使用2-32細胞)[PratherR.S.,etal.J.Anim.Sci.,1987,]；山羊(使用8-細胞)[張涌，“國外畜牧-草食家畜分冊”，1993]；小鼠(使用ES-細胞)[TsundaY.,etal.JournalofReproductionandFertility.,1993]。1997年，Willmult等人應用乳腺上皮細胞進行核移植產生了綿羊多利[WillmutI.,etal.,Nature.1997]。隨后，又獲得了不同類型的體細胞克隆動物(1)胎兒成纖維細胞核移植綿羊[SchniekeA.E.,etal.,Science,1997]，(2)胎兒成纖維細胞核移植牛[GibelliJ.B.,etal.IBID,1998]，(3)輸卵管上皮細胞核移植牛等。在異種動物核移植方面，也取得了可喜的進展，Dominko等人應用體外成熟的牛卵母細胞作通用的受體細胞，分別用牛、綿羊、豬、猴、兔的皮膚成纖維細胞(G0期，饑餓2-9天)作供核細胞，獲得的重構胚在體內培養7天后約有14-38％的重構胚發育到椹桑或囊胚。據美國AdvanceCellTechnology公司98年11月23日宣布，將體細胞移植到去核的牛卵母細胞中，獲得了發育至囊胚的胚胎并培育出具有全能性的人胚性干細胞。以上核移植動物或發育的重構胚均是應用細胞融合的方法制備的。此外，1988年WakayamaT等人利用小鼠的另一種體細胞-即卵丘細胞，先將該體細胞的細胞質去除，然后將細胞核直接注射到去核的鼠卵細胞細胞胞質內，產生了核移植小鼠[WakayamaT.,etal.,Nature,1988]。然而，上述的產生治療性克隆植入前胚胎(尤其是用于人的)的方法所涉及到的步驟仍很繁多，因此本領域迫切需要步驟更少、效率更高獲得治療性克隆植入前胚胎的方法。本發明的目的就是提供一種步驟更少，效率更高的用人的體細胞來制備治療性克隆植入前胚胎的方法。在該方法中，不對人的體細胞進行去除細胞質的處理，而是將體細胞直接注射到去核的卵母細胞中，并省去了細胞融合步驟；或者用于供核的人體細胞直接注射入非人哺乳動物的卵周隙中，再用電刺激法使人體細胞融合進卵母細胞內。在本發明的第一方面，提供了一種治療性克隆植入前胚胎的制備方法，該方法包括以下步驟提供去核的非人哺乳動物供質卵母細胞和用于供核的人體細胞；用顯微注射法，將用于供核的人體細胞直接注射人所述的去核供質卵母細胞，形成重構卵；或者將用于供核的人體細胞直接注射入非人哺乳動物的卵周隙中，再用電刺激法使人體細胞融合進卵母細胞內，形成重構卵；對所述的重構卵進行激活處理，形成激活的重構卵；將所述的激活的重構卵移植到非人寄母動物的輸卵管中，作短暫培養，再回收發育的早期胚胎。本發明的方法與現有技術相比，其發明點在于省去了對體細胞去除細胞質的處理步驟，而是將體細胞直接注射到去核的卵母細胞或卵周隙中。在另一實例中還省去了細胞融合步驟。由于省去了這些步驟，因此導致獲得治療性克隆植入前胚胎的方法更加簡易，效率更高。在說明書附圖中，圖1顯示了本發明一實例中產生治療性克隆植入前胚胎的流程圖。圖2顯示了對本發明獲得的治療性克隆植入前胚胎進行PCR檢驗的電泳圖。圖中的檢測樣品如下goat1和2分別為莎能奶山羊細胞、和本地山羊細胞，human1和human2為來自2個治療性克隆植入前胚胎的細胞。現描述一下現有技術中的獲得和應用治療性克隆的過程(DavorSolter和JohnGearhart,Science,1999年5月1468-1470)。該過程主要包括以下階段(1)治療性克隆植入前胚胎的獲得在病人身上取下活體組織進行體外細胞培養，將體細胞移入去核的卵母細胞的卵周隙中，通過激活使體細胞與卵母細胞融合，融合卵進行體內或體外培養使之發育成囊胚；(2)ES細胞建立與誘導分化將發育成的囊胚經免疫外科手術方法處理，將囊胚的內細胞團細胞在體外培養成ES細胞，將ES細胞在誘導物的作用下，使之分化成各種器官或組織(如肌肉、神經、造血細胞等)。(3)組織或器官移植將誘導分化成的組織或器官通過外科手術方法移植到病人身上。本發明主要涉及上述過程中的第一階段，即治療性克隆植入前胚胎的獲得。本發明人在國際上首次應用人的臍帶內皮細胞和成纖維細胞移植到莎能奶山羊卵母細胞內，獲得了發育到囊胚的胚胎。本發明人在成功地對體細胞克隆哺乳動物的制備方法的進行改進的基礎上，通過進一步研究完成了本發明。對于將體細胞直接注射入卵母細胞，從而制備重構卵的詳細內容，還可參見同一申請人1999年11月提交的發明名稱為“一種體細胞克隆哺乳動物的制備方法”的專利申請，該專利申請在此引用作為參考。本發明方法，主要包括以下步驟(1)獲得提供細胞質的卵母細胞(簡稱為“供質卵母細胞”)。一般地，獲得供質卵母細胞可由以下兩種方法獲得。一是從卵巢卵泡上取出未成熟卵母細胞，并在體外成熟；一是供細胞質的哺乳動物經超數排卵誘導后，從其輸卵管內沖出中Ⅱ期卵母細胞。這些獲得供質卵母細胞的方法都是本領域的常規技術。較佳地，供質卵母細胞是通過母畜的超數排卵而獲得的。(2)獲得供核的人體細胞(即提供細胞核的人的體細胞)一般地，獲得供核細胞可采用成年動物的體組織(如皮膚)、未期體細胞(如顆粒細胞)等，將有關組織剪碎和消化后，分散成單個體細胞，然后在體外培養，形成細胞系。也可直接消化成單個體細胞。較佳地，應用病人的體組織(如皮膚等)或將剛出生的嬰兒臍帶內皮或成纖維細胞，在體外培養成系用于供核，或將細胞冷凍保存，待發生意外事故或發生疾病后進行體細胞克隆。本領域常規的制備供核體細胞的方法都可適用于本發明。(3)卵母細胞的去核一般，將卵母細胞的核遺傳物質在顯微鏡下應用去核針機械去除，從而獲得去核的卵母細胞。本領域常規的去核方法都可適用于本發明。(4)移核現有技術中的移核過程通常有兩種方式。第一種是將含細胞質的體細胞移入卵周隙中，然后將注入卵周隙的體細胞和卵母細胞在融合液內通過電刺激而發生融合，形成融合式的移核卵(重構卵)。然而，在制備治療性克隆植入前胚胎中從未將該方法應用于人體細胞。第二種是先將體細胞的細胞質去除，再把體細胞核(不含或含少量胞質)直接注入去核卵母細胞的胞質內，形成注射式的移核卵(重構卵)。在本發明中，一種方法是將用于供核的人體細胞直接注射人非人哺乳動物的卵周隙中，再用電刺激法使人體細胞融合進卵母細胞內，形成重構卵。另一種更佳的方法是將供核的人體細胞直接用顯微注射法而注入去核的非人哺乳動物的卵母細胞中，形成重構卵。在后一種方式，既不必對人體細胞去除胞質，也不必先將體細胞移入卵周隙中再進行融合處理。(5)激活對步驟(4)中形成的重構卵，通過激活處理，形成被激活的重構卵。本領域中的常規的激活處理方法都可用于本發明。通常，對重構卵的激活處理可用電刺激和/或化學刺激法進行。較佳地，在本發明中對重構卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-100μs；(ⅱ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-100μs(更佳地25-80μs)，然后再如下進行化學法激活即在5-20μM離子霉素中激活5分鐘，并在1-5μM6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小時。(6)體內培養本領域常規的對重構卵進行體內或體外培養，都可適用于本發明。簡而言之，對于步驟(5)中形成的被激活的重構卵，可以將其移入寄母動物的輸卵管而在體內進行短暫培養(較佳地，所述的重構卵被移植到同步發情的非人寄母動物的輸卵管中)，或者利用飼養細胞(feedercell)(例如輸卵管上皮細胞)進行體外培養，然后回收重構胚并觀察重構胚的發育情況。合格的發育胚胎可建立用于ES細胞系或可被冷凍保存備用。此外對于獲得的發育的胚胎，可通過各種檢驗方法來加以檢驗，例如用隨機引物PCR法、DNA指紋法等。一種優選的方法是用隨機引物PCR法。通過上述的比較可以看出，本發明的方法與現有技術相比，其特點在于首次應用人的臍帶內皮細胞和成纖維細胞移植到莎能奶山羊卵母細胞內，獲得了發育到囊胚的胚胎。此外，本發明的特點還在于，可省去了對體細胞去除細胞質的處理步驟，而是將體細胞直接注射到卵周隙中并融合，或者將體細胞直接注射到去核的卵母細胞(這還進一步省去了細胞融合步驟)。由于省去了一個或多個步驟，因此導致獲得治療性克隆植入前胚胎的方法更加簡易，效率更高。在本發明中，可用于提供供核卵母細胞的動物包括各種哺乳動物，較佳地是非人的哺乳動物。可用于本發明方法的哺乳動物的例子包括(但并不限于)羊、牛、豬、馬、狗、貓、兔、小鼠和大鼠。適用于本發明方法的體細胞包括各種已分化的體細胞，例如來自各種組織(如皮膚、乳腺、輸卵管、肌肉等)和器官(如耳、卵巢等)的細胞，尤其是分化程度較低的體細胞，例如新生兒臍帶的各類體細胞。可用于本發明方法的體細胞的例子包括(但并不限于)新生兒臍帶的各類體細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞。本領域中各種獲得卵母細胞的方法以及對卵母細胞進行去核處理的方法都可用于本發明。在本發明的一個實例中，去核的哺乳動物供質卵母細胞是這樣獲得的通過超數排卵法獲得處于中Ⅱ期卵母細胞，然后進行去核處理獲得去核的哺乳動物供質卵母細胞。在本發明方法中，在體細胞被直接注射之前，可對其進行預處理，以使其充分分散成單個細胞。例如，在如下條件下進行處理將培養的體細胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再應用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃,3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。在本發明方法中，還包括驗證步驟即對重構胚隨機引物PCR方法或DNA指紋分析法加以分析，以驗證是否胚胎的基因組是否來自人的基因組。一種可行的方法是從獲得的早期胚胎中吸取部分細胞，然后用隨機引物PCR方法或DNA指紋分析法對發育的早期胚胎進行檢驗。一種優選的檢驗方法是隨機引物PCR法中使用如下引物5′-ACCCCCGAAG-3′；并且PCR反應程序是90-95℃3-10min；然后是90-95℃6-15秒→34-40℃12-20秒→70-74℃20-40秒，共35-40個循環；最后在72℃下延伸2-10分鐘。下面結合實施例進一步詳細地描述本發明，應理解，這些實施例僅用于闡述目的而不用于限制本發明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例A、方法供質母畜超數排卵技術(提供卵母細胞)超數排卵是指采用激素誘導動物一次排出比正常排卵數多若干倍的方法。通過激素[孕馬血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素釋放因子(LRH)]處理，使母畜呈非季節性排卵，并且在一次排卵中，能排出較多的卵子。對激素處理過的、使用過的動物，仍可以再重復超排使用3-4次，只是在時間間隔、激素用量等方面有所不同，這樣充分地利用了試驗動物。有多種超數排卵技術可供使用。在本發明中采用的具體方法是每只動物肌注氯前列烯醇(PG，上海計劃生育研究所)0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG10-14天后開始超排，即首先肌肉注射FSH(寧波激素制品廠)，用量按7-12IU/kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時發情時注射LRH(上海東風制藥廠)，25ug/次，注射LRH后28-30小時回收卵母細胞。受體母畜的激素處理為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量與供體相同。人體細胞系的建立在獲得治療性克隆早期胚胎過程中，人體細胞的外培養及細胞系的建立亦很重要。其方法為將剛出生的臍帶組織貯藏在10-37℃保溫瓶內，迅速拿到實驗室，0.25％胰酶消化，根據消化的時間，首先獲得內皮細胞，隨著消化時間的延長，獲得成纖維細胞。用M199或RMl640等培養液(加10％胎牛血清)培養，傳代，遺傳分析，冷凍保存或作供核用。卵母細胞的收集供卵母細胞胞質的供體莎能奶山羊在注射LRH后26-30小時，進行卵母細胞的收集。收集是通過手術的方法，在母畜的腹部作一切口，將母畜的輸卵管與卵巢暴露在體外，用沖卵液(含5％BSA的F10培養液)從輸卵管中沖出卵母細胞，將收集的卵母細胞培養在CZB培養液中。卵母細胞去核將卵母細胞移人手術液中，在顯微鏡下，用持卵針固定卵母細胞，卵母細胞排出的極體處于鐘表3點位置，去核針正對著或稍偏離極體去除極體與一部分胞質。人內皮細胞或成纖維細胞直接注射人體細胞的處理，即將培養的體細胞用0.25％的胰蛋白酶消化以后，再應用蛋白酶E(1-10mg/L),37℃,5％CO2中消化1-10分鐘。洗滌以后，移人手術液中，再將體細胞注射進去核的卵母細胞中，形成重構卵。或者，將體細胞直接注射到卵周隙中，然后如下進行融合處理將注射到卵周隙的人體細胞和卵母細胞在融合液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mMMgSO4)中電刺激(600-800V/cm，每次60-80μs)三次，使之融合，從而形成重構卵。重構卵的融合與激活重構卵激活，將重構卵在激活液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mMMgSO4)中電刺激(600-800V/cm，每次持續40μs)后，再用化學方法激活10μM離子霉素5分鐘，2μM6-DMAP(含7.5μg/ml細胞松馳素B)處理3-4小時，激活后的重構卵移入正常的培養液(CZB培養液)中培養。重構胚體內培養應用手術的方法，將激活的重構卵吸入移卵管內，將移卵管從莎能奶山羊或本地山羊的輸卵管喇叭口處插入，將卵移進輸卵管內，隨后在輸卵管與子宮連拉部用縫線結扎。在體內培養6天后，剪下輸卵管，用培養液沖出胚胎，觀察胚胎發育情況。早期發育胚驗證采用PCR方法對發育的胚胎進行驗證，即該胚胎是否是來自人體細胞。方法如下從發育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分細胞進行PCR檢測，所用的隨機單引物(10bp)的序列為5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反應程序是先94℃4分鐘，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40個循環)，最后是72℃4分鐘。將篩選出的胚胎用于建立ES細胞系或冷凍保存。B、材料在本發明中所用的M199培養基、RM1640培養基、F10培養基和CZB培養基等都是本領域中常規的培養基(培養液)。其中，CZB培養液的配方如下表1、CZB培養液實施例1將人的體細胞移入莎能奶山羊卵母細胞中制備囊胚細胞在該實施例中，所用的具體技術路線如圖1所示。具體而言，包括以下步驟1、人臍帶內皮細胞或成纖維細胞獲得與培養從醫院無菌地取約10-40cm長的剛出生嬰兒的臍帶，貯藏在10-37℃保溫瓶內，迅速拿到實驗室，用0.25％胰酶消化液注射到臍帶內。根據消化的時間，首先(約1小時)獲得內皮細胞。隨著消化時間(約2-4小時)的延長，獲得成纖維細胞。用M199或RM1640等培養液(加10％胎牛血清)培養，傳代，遺傳分析，冷凍保存或作供核。2、奶山羊超排與寄母羊同步奶山羊超排每只動物肌注PG，0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG10-14天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時發情時注射LRH，25ug/次，根據羊的體重作適當調整。寄母羊的同步為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。3、卵母細胞的回收奶山羊注射LRH后28-30小時后手術回收卵母細胞。按手術常規剪毛、消毒、打開腹腔、拉出子宮與輸卵管，用10ml針筒7號針頭，沖卵液為含5％BSA的F10培養液，沖出輸卵管內的卵子接于園杯內。在體視解剖鏡下，將卵母細胞檢出置于CZB培養液中，37℃,5％二氧化碳培養箱中培養。4、卵母細胞去核與注射人的體細胞將卵母細胞移于含7.5ug/ml細胞松弛素B的CZB培養液中20min，再移至CZB(含20mMHEPES)培養液中，同時將已消化成球形的臍帶內皮細胞或成纖維細胞亦移至該液中。按常規將卵母細胞去核，去核后再將人的臍帶內皮細胞或成纖維細胞直接注入卵母細胞的胞質內，形成的細胞被稱之為重構卵。重構卵置于CZB液中培養30分鐘，然后激活。5、激活與包埋重構卵于CZB+細胞松弛素B(7.5μg/ml)+離子霉素(10μm)中，37℃培養5分鐘。移至CZB+細胞松弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μm)370C，液滴法培養2-6小時。激活后的重構卵移至CZB中，待包埋。包埋采用雙層包埋。所用的包埋液是0.8％與1.0％瓊脂糖(低熔點膠，約40℃)溶液。該包埋液是這樣制備的在10ml錐形玻璃離心管內將適量的瓊脂糖與生理鹽水混合煮沸，至完全溶解后置于42℃，水浴待用。包埋時，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，將待包埋的卵母細胞移入血清層，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含剛倒出的0.8％瓊脂糖的小平皿中，將卵母細胞的位置移動2-4次(起到洗滌作用)，再均勻吸卵(卵與卵之間有一定的距離，但相靠不是太遠)，移至PBS中。讓其自然凝固，再分割，換一口徑稍大的吸管，按相同方法進行第二層包埋，不同點在于包埋液的瓊脂糖濃度為1.0％。6、移植與回收應用手術的方法，將包埋后的重構卵吸入移卵管，從輸卵管喇叭口處插入移卵管，將卵移進輸卵管內。隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結扎。在體內培養6天后，剪下輸卵管，用培養液沖出胚胎，觀察胚胎發育情況。7、發育胚胎檢驗與保存采用PCR方法對發育的胚胎進行驗證，即該胚胎是否是來自人體細胞。方法如下從發育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分細胞進行PCR檢測，所用的隨機單引物(10bp)的序列為5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反應程序是先94℃4分鐘，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40個循環)，最后是72℃4分鐘。發育至囊胚的胚胎的保存可利用其內細胞團細胞進行體外培養，建立ES細胞；或者將發育的胚胎液氮冷凍保持備用。結果如下(一)超數排卵1、超排奶山羊總數20只2、奶山羊超排效果卵巢發育率(以卵巢直徑＞1cm計)85％(17/20)平均每只奶山羊排卵數11.2枚(225/20)平均每只奶山羊回收卵數11.7枚(235/20)回收卵效率104％(235/225)(在計排卵點數時有誤，有的幾個排卵點緊靠在一起)(二)受體同步發情通過PG處理后，羊的同步率為78％(20/26)。(三)體細胞培養建立嬰兒臍帶內皮細胞或成纖維細胞庫。在傳代供過程中進行了染色體數分析。觀察了100分裂相，2倍體(46條染色體)占75％。本試驗所用的人體細胞是臍帶內皮細胞或臍帶成纖維細胞，未進行冷凍與饑餓處理。(四)卵母細胞去核與注射人的體細胞去核總卵數153枚，其中成活148枚，成活率96.7％體細胞注射后成活卵數133枚重構卵存活率89.8％(五)重構胚發育情況重構胚早期發育情況表<tablesid="table3"num="003"><table>移植卵數回收卵數重構卵發育率(％)2-4細胞32-64細胞桑椹早期+晚期囊胚1339817231224</table></tables>(六)發育胚胎的驗證用發育胚胎的細胞與山羊胚胎(囊胚)的DNA，分別進行隨機引物PCR分析，其檢測結果見圖2，其中goat1和2分別為莎能奶山羊細胞、和本地山羊細胞，human1和human2為來自2個治療性克隆植入前胚胎的細胞。結果表明，發育胚胎的細胞的兩個樣品間是一致的，兩種山羊囊胚間亦是一致的；而山羊囊胚與發育胚胎(其基因組來自人體細胞)之間的差別是很明顯的。因此，這證實發育胚胎來自人，即胚胎細胞中含有的是人的染色體和基因組。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1．一種治療性克隆植入前胚胎的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟提供去核的非人哺乳動物供質卵母細胞和用于供核的人體細胞；用顯微注射法，將用于供核的人體細胞直接注射入所述的去核供質卵母細胞，形成重構卵；或者將用于供核的人體細胞直接注射入非人哺乳動物的卵周隙中，再用電刺激法使人體細胞融合進卵母細胞內，形成重構卵；對所述的重構卵進行激活處理，形成激活的重構卵；將所述的激活的重構卵移植到非人寄母動物的輸卵管中，作短暫培養，再回收發育的早期胚胎。2．如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟從獲得的早期胚胎中吸取部分細胞，用隨機引物PCR方法對發育的早期胚胎進行檢驗。3．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人的體細胞選自下組的細胞新生兒臍帶的各類體細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞。4．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述體細胞在直接注射之前，在如下條件下進行處理將培養的體細胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再應用1-10mg/L蛋白酶E,36-39℃,3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。5．如權利要求1所述的方法，其特征在于，對重構卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-100μs；(ⅱ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-100μs，然后再如下進行化學法激活即在5-20μM離子霉素中激活5分鐘，并在1-5μM6-DMAP激活1-6小時。6．如權利要求1所述的方法，其特征在于，該非人哺乳動物選自羊、牛、豬、馬、狗、貓、兔、小鼠和大鼠。7．如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括驗證步驟對重構胚進行DNA指紋分析，以驗證是否是克隆動物。8．如權利要求1所述的方法，其特征在于，提供去核的非人哺乳動物供質卵母細胞是這樣獲得的通過超數排卵法獲得處于中Ⅱ期卵母細胞，然后進行去核處理，獲得去核的非人哺乳動物供質卵母細胞。9．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重構卵被移植到同步發情的非人寄母動物的輸卵管中作短暫培養，以獲得發育的胚胎。10．如權利要求2所述的方法，其特征在于，在隨機引物PCR法中所用的引物是5′-ACCCCCGAAG-3′；且PCR反應程序是90-95℃3-10min；然后是90-95℃6-15秒→34-40℃12-20秒→70-74℃20-40秒，共35-40個循環；最后在72℃下延伸2-10分鐘。全文摘要本發明提供了治療性克隆植入前胚胎的制法,包括:提供去核的非人哺乳動物供質卵母細胞和供核人體細胞;用顯微注射法,將供核體細胞直接注入去核供質卵母細胞,或者將供核體細胞直接注入卵周隙,再用電刺激法使人體細胞融合進卵母細胞,從而形成重構卵;激活重構卵;將激活的重構卵移入非人寄母動物輸卵管,短暫培養后再回收發育的早期胚胎。該方法可提供用于建立ES細胞的胚胎,進而獲得用于移植的組織和器官。文檔編號A61D19/04GK1302591SQ9911995公開日2001年7月11日申請日期1999年11月2日優先權日1999年11月2日發明者成國祥,陳建泉申請人:上海中路生物工程有限公司