專利名稱：一種昆蟲病原線蟲的液體培養方法
技術領域：
本發明涉及液體培養方法大量生產作為生物殺蟲劑的昆蟲病原線蟲。
昆蟲病原斯氏科Steinernematidae與異小桿科Heterorhabditidae線蟲是新型生物殺蟲劑。這類線蟲具有廣泛的寄主范圍；對寄主具主動搜尋能力，特別是對土棲性及鉆蛀性害蟲；對人畜、環境安全。近年來，已廣泛應用于防治農、林、牧草及衛生等害蟲，受到國內外學者及商業部門的高度重視，并走向商品化。
這類線蟲是以感染期蟲態(infective juveniles,IJ)隨寄主食物或從昆蟲的自然開口(如肛門、氣孔)、節間膜進入昆蟲體內，隨后釋放腸腔中攜帶的Xenorhabdus屬(目前與斯氏科線蟲共生)或Photorhabdus屬(目前與異小桿科線蟲共生)的共生細菌。線蟲以及共生細菌分泌的毒素(毒性因子)導致昆蟲死亡。
昆蟲病原線蟲的大面積田間應用要求線蟲的生產走向商業化。目前，線蟲的工業化培養系統是通過無菌操作技術于各種人工培養基中加入單一共生細菌和無菌線蟲完成的，即線蟲的單菌體外培養系統。根據培養基質可分為固體培養[Bedding,R.A.(1984)Annals of Applied Biology 104,117-120；Wouts,W.M.(1981)Journal of Nematology 13,467-469]和液體培養[Pace et al.(1986)PCT Patent Application No.86/01074；Friedman et al.(1991)PCT PatentApplication No.89/04602；Surrey & Davies(1996)Journal of InvertebratePathology 67,92-99；Han,R.C.(1996)Nematologica 42,546-553；Ehlerset al.(1998)Biocontrol 43:77-86；Tachibana et al.(1997)US patent,Application No.403879]。固體培養方法技術含量相對較低，容易操作，可適應多種線蟲。但需要大量人力、空間，派放大量廢物。液體培養克服了固體培養的不足，是線蟲產業化生產的主要方法。
昆蟲病原線蟲的生活史包括卵、一至四齡幼蟲和成蟲階段。此類線蟲均具有一個三齡的感染期蟲態。該齡期的線蟲不取食，于土壤中能存活一段較長時間，隨時可入侵可能存在的寄主昆蟲。在線蟲的單菌體外培養系統中，線蟲的典型發育模式如下。當線蟲和共生細菌接入培養基后，由共生細菌產生的化學信息物質(Food signal)誘導感染期線蟲發育，從感染期變為三齡期(L3)，四齡期(L4)至成蟲。卵孵化后，從一齡幼蟲(L1)，二齡幼蟲(L2)，如營養條件良好，繼續發育至L3,L4和新一代成蟲；如營養條件惡化，L2可發育為感染期線蟲。新一代感染期線蟲仍可繼續發育為L3，進行新的生活周期。斯氏線蟲采用雌雄異體的繁殖方式；而異小桿線蟲從感染期幼蟲發育的第一代成蟲為嚴格的雌雄同體，第二代成蟲可存在雌雄異體和雌雄同體的混合個體。昆蟲病原線蟲的感染期幼蟲是能侵染昆蟲寄主的蟲齡。在應用上，只有感染期線蟲對環境因子具有一定的忍耐性，且對昆蟲有感染力。因此，線蟲體外液體培養時，感染期線蟲占其它蟲齡的比例以及培養周期至關重要。
一般地說，在營養豐富的培養基中加入高密度的線蟲將有利于在最短的時間內獲得最大數目的感染期線蟲。但加入高密度的線蟲將降低線蟲的繁殖倍數，并且在經濟上不合算。如果線蟲能在第一代中達到最大數量的感染期蟲態，將會縮短培養時間和降低培養成本。Pace et al.(1986)(PCT Patent Application No.86/01074)報道，以無菌蒸餾水稀釋培養液并將培養液溫度降至15℃，可得到60-90％的感染期線蟲。但該方法操作時，既不方便又增加費用。Friedman et al.(1989)Tachibana et al.(1997)的專利中描述了線蟲的培養基，以及根據線蟲不同的齡期控制攪拌速率的方法，但未提及控制感染期線蟲形成的方法。
本發明的目的是提出一種能控制并提高感染期線蟲產量的昆蟲病原線蟲的液體培養方法。
本發明所提供的昆蟲病原線蟲的液體培養方法，其內容包括在常用的人工細菌培養基中，于無菌條件下接入初生期線蟲的共生細菌和線蟲，在攪拌、供氧的條件下，例如在在搖床震蕩培養或供氧發酵罐中進行線蟲液體培養，其特點是在線蟲的發育期，主要是在線蟲的關鍵發育齡期加入抗菌物質(即抗菌素)。使用的抗菌素包括所有對線蟲共生菌株有抑制作用的種類，如金霉素(Chlorotetracycline)，鏈霉素(Streptomycin)，氯霉素(Chloramphenicol)，氨芐青霉素(Ampicillin),Nalidixic acid等，優先選擇的是鏈霉素。抗菌素劑量范圍為0.01-1μg/ml，依不同共生菌株和抗菌素種類而異。這一劑量范圍的抗菌素可使部分菌株(＜20％CFU；CFU=colony forming unit)發生型變。所述的線蟲的關鍵發育齡期一般選擇在新一代一齡線蟲L1出現后。
本發明方法中所述在常用的人工細菌培養基中所接入的線蟲可以是各種齡期的線蟲，而以接入感染期線蟲為最佳。
本發明在線蟲液體培養的發育齡期，利用抗菌物質于培養液中降低細菌密度和誘導共生細菌的變異型，降低了菌液的營養信息，改變部分共生細菌的生理狀態，以控制和提高感染期線蟲的形成，使線蟲幼蟲向感染期線蟲方向發育，此外，還控制了業已形成的感染期線蟲的進一步發育。本發明能大大提高培養液中感染期線蟲的比例，縮短培養時間，提高昆蟲病原線蟲的液體培養效果。本方法可使線蟲于8-16天內(依線蟲種類而異)達到高比例的感染期蟲態(＞95％)。
下列實驗及操作實例是進一步對本發明的說明。應該指出，這些范例都是解說性的，不應該當作對本發明的限制。實例中僅描述S.carpocapsae A24線蟲和H.bacteriophora H06線蟲，但本專利的方法適用于所有線蟲種和品系。
實施例一于500ml三角瓶中加入100ml液體培養基(2％黃豆粉，1％面粉，0.5％酵母膏，1.2％蛋粉，3％玉米油和92.3％水)，121℃下高壓消毒30分鐘。然后接入從S.carpocapsae A24線蟲中分離出的X.nematophilus初生型共生菌(5×108菌體)，置于25℃、150rpm下搖床培養48小時，再接入5000條/ml S.carpocapsae感染期線蟲，接入線蟲后第二天起取樣于解剖鏡下檢查線蟲的發育情況，培養4天后于培養瓶中加入0.05μg/ml硫酸鏈霉素。48小時后，取樣于解剖鏡下檢查線蟲的發育情況，接蟲后第8,10,12和16天計數線蟲產量和感染期線蟲比例。
實施例二于500ml三角瓶中加入100ml液體培養基(2％黃豆粉，1％面粉，0.5％酵母膏，1.2％蛋粉，3％玉米油和92.3％水)，121℃下高壓消毒30分鐘。然后接入從H.bacteriophora線蟲中分離出的P.luminescens初生型共生菌(5×108菌體)，置于25℃、150rpm下搖床培養48小時，再接入5000條/mlH.bacteriophora感染期線蟲，接入線蟲后第二天起取樣于解剖鏡下檢查線蟲的發育情況，培養6天后于培養瓶中加入0.05μg/ml硫酸鏈霉素。48小時后，取樣于解剖鏡下檢查線蟲的發育情況，接蟲后第8,10,12和16天計數線蟲產量和感染期線蟲比例。
上述實施例一和實施例二所述的Xenorhabdus和Photorhabdus初生型共生細菌的分離的方法如下從昆蟲病原線蟲感染的大蠟螟末齡(七齡)幼蟲Galleria mellonella，置于25℃下，昆蟲死亡后(一般2至4天)，以70％酒精體表消毒死蟲，然后用無菌剪刀剪開蟲體，取血淋巴劃NBTA,NA和麥康凱平板。根據Akhurst(1980)(Journal of General Microbiology 121,303-309)描述的方法鑒定線蟲共生細菌。從S.carpocapsae A24線蟲中分離出X.nematophilus共生菌；從H.bacteriophora線蟲中分離出P.luminescens共生菌。
實施例一和實施例二所述的昆蟲病原線蟲液體培養方法與常規方法(即未加抗菌物質的)比較結構顯示加入硫酸鏈霉素后，S.carpocapsae線蟲于8天時的感染期線蟲比例達到95％，感染期線蟲產量為267×1000/ml；而未加硫酸鏈霉素的培養瓶的感染期線蟲比例為6％，感染期線蟲產量為18×1000/ml，雖然線蟲總產量為304×1000/ml。12天后，加入硫酸鏈霉素的培養瓶的感染期線蟲比例達到97％，而未加硫酸鏈霉素的培養瓶的感染期線蟲比例為32％。可見，加入硫酸鏈霉素后，使線蟲向感染期蟲態發育，縮短了培養時間。
H.bacteriophora線蟲培養液中加入硫酸鏈霉素后，于10天時的感染期線蟲比例達到96％，感染期線蟲產量為197×1000/ml；而未加硫酸鏈霉素的培養瓶的感染期線蟲比例為84％，感染期線蟲產量為178×1000/ml。16天后，加入硫酸鏈霉素的培養瓶的感染期線蟲比例達到98％，而未加硫酸鏈霉素的培養瓶的感染期線蟲比例為89％。可見，加入硫酸鏈霉素后，也使線蟲向感染期蟲態發育，縮短了培養時間。
權利要求
1．一種昆蟲病原線蟲的液體培養方法，包括在人工培養基中，于無菌條件下接入初生型線蟲共生細菌和線蟲，在通氣、攪拌的培養環境下進行線蟲液體培養，其特征在于在線蟲的發育期加入抗菌物質。
2．根據權利要求1所述的昆蟲病原線蟲的液體培養方法，其特征在于所述的抗菌物質的加入時間為線蟲新一代一齡幼蟲L1出現后的發育關鍵齡期。
3．根據權利要求1所述的昆蟲病原線蟲的液體培養方法，其特征在于所述的抗菌物質的加入量為每毫升培養基0.01～1μg。
4．根據權利要求1或2或3所述的昆蟲病原線蟲的液體培養方法，其特征在于所述的抗菌物質為鏈霉素。
5．根據權利要求1所述的昆蟲病原線蟲的液體培養方法，其特征在于培養中在人工培養基中所接入的線蟲的感染期線蟲。
全文摘要
本發明提供一種用作生物殺蟲劑的昆蟲病原線蟲的液體培養方法,該方法是在昆蟲病原線蟲液體單菌培養系統中,于線蟲發育的關鍵齡期加入抗菌物質,以改變菌體密度和誘導共生菌產生變異型,控制感染期線蟲的形成,提高感染期線蟲的產量,本方法可使線蟲于8～16天內,達到比例高達95%以上的感染期蟲態。
文檔編號A01N63/00GK1300817SQ9911729
公開日2001年6月27日 申請日期1999年12月17日 優先權日1999年12月17日
發明者韓日疇, 李麗英 申請人:廣東省昆蟲研究所