專利名稱:生物誘變技術的制作方法
生物誘變技術涉及使用誘變因子誘導植物產生突變，改良基因型。
誘變技術在植物育種上的應用始于19世紀20年代的輻射誘變育種，其后40年代又開始了化學誘變育種;隨著農業生產的不斷發展，要求人們采用新的技術方法創造自然界中尚未發現的優良變異，從而培育出更多的優良品種;由于誘變育種在這方面具有一定的優點，而且取得了一定的成效，因此誘變技術發展較為迅速，在育種工作中占有相當的地位。目前誘變技術已在微生物育種和植物育種中得到廣泛應用的是輻射和化學誘變育種，即利用物理和化學因素作誘變劑，誘導生物發生遺傳性的變異，然后根據育種目標進行選擇，以培育新的品種。物理和化學誘變可以提高突變頻率，比自然突變頻率高100-1000倍，突變譜范圍廣，可以在短時間內有效地改良植物品種的個別性狀如增強抗逆性、改進品質等，為育種工作創造了極其豐富的原始材料。然而物理、化學誘變需要一定的設備條件，物理、化學誘變所產生的突變，其頻率還是較低，特別是有經濟價值的性狀突變發生頻率低;物理、化學誘變劑對人體有不同程度的危害，需要一定的保護設施;誘變處理過程中，還對環境造成了一定程度的污染。
生物誘變技術是將生物的活物質如DNA或微生物如病毒、噬菌體等引入另一生物進行誘變。該技術在微生物育種中應用的研究工作已經開始。1962年Alikhanian觀察到放線菌噬菌體的顯著誘變效應，他們報告利用放線菌噬菌體選育VB12、鏈霉素、紅霉素和竹桃霉素的生產菌株;我國的微生物工作者在抗噬菌體菌株的選育試驗中發現敏感菌經不同噬菌體感染后，部分菌株獲得抗性，抗菌素產量產生變異，得到了比原種產量高的變異菌株，形態上的變異大于物理、化學誘變，這說明噬菌體侵入寄主后導致了寄主性狀的改變。
用生物誘變技術誘導高等植物產生突變的研究工作僅見于通過離體培養進行細胞或組織的抗性選育。Carlson首次用離體選擇技術將煙草野火病毒素類似物加入培養基中篩選抗病細胞系，并建立了完整的植株;以后又有許多學者用類似方法獲得了玉米抗小斑病，馬鈴薯抗晚疫病、甘蔗抗眼點病，油菜抗黑腳病的突變體及其再生植株等等。1982-1984年江蘇農科院農業生物遺傳生理研究所的研究人員用水稻愈傷組織直接接種白葉枯病原菌篩選抗菌愈傷組織，分化再生植株，並鑒定了再生植株及后代的抗病性的穩定性和可遺傳性。這里開始了用活體病原菌感染愈傷組織從中篩選抗性細胞系。
目前在農業生產中的抗性育種，雖然也采用了將植物病原菌直接引入寄主作物中的方法，但其目的是鑒定作物的抗病性，再在其中選擇高抗材料以期得到抗性品種。
至今尚未見到直接將病原微生物引入寄主作物，使之產生各種突變，從中選擇具有優良性狀的變異，用于品種選育。
本發明旨在探索一種經濟有效、簡易可行、安全可靠的誘導突變的方法，既不需要物理、化學誘變所需的特別的設備條件，又能獲得比物理、化學誘變頻率更高的突變，為作物育種開辟更為豐富的基因資源。
本發明是基于病原菌能引變寄主的遺傳提出的。
本發明的具體解決方案如下在適宜的溫濕度條件下，在寄主作物的營養生長時期，將植物病原引入寄主作物植株的生長點及四周，使之產生各種性狀的變異，在M1代中淘汰未發病(O級)和輕度發病(Ⅰ級)的個體，選留發病重(Ⅱ級)和嚴重(Ⅲ級)，即地上部分經歷了二次以上調萎死亡的再生植株，再在M2代中選擇突變體;作生物誘變因子的有真菌性病原菌、細菌性病原菌和病毒性病原等，其真菌性病原菌和細菌性病原菌的制備方法可以是直接獲取作物感病部位的病原菌制成懸浮液，也可以是當年或隔年分離培養的病原菌;當年分離的強毒菌株需經鈍化處理或直接引入抗性材料，生物誘變處理的適宜溫濕度應選擇在使病原菌導致寄主緩慢致死的范圍內，其處理劑量應既能使病原接種上寄主材料，又要使發病過程的潛伏期盡可能延長。
實施生物誘變技術應遵循下列原則1、生物誘變處理的適宜時期應是寄主作物細胞分裂最旺盛時期，此階段細胞中DNA的活動最劇烈，對外界因素的反應最敏感。禾本科植物中生物誘變的適宜處理時期為分蘗期。
2、生物誘變處理的部位以植株生長點及四周為宜。生長點是細胞數目最多、分裂最旺盛部位，因而突變產生的機率大。
3、生物誘變處理還應選擇一個適宜突變誘發的外界條件。瀕臨死亡的細胞，其DNA的復制易出現錯誤，而導致變異，因而選擇一定的溫濕度條件既控制發病速度又促進寄主再生，創造一個緩慢致死的條件是誘發突變的必要條件。
4、突變細胞成為性細胞后，變異可遺傳后代，因此誘變處理時期還應掌握在性細胞形成前，以獲得可遺傳的變異。
下面結合實例對本發明作進一步的闡述一、水稻白葉枯病原菌誘變寄主水稻的具體程序和結果為1、病原的準備可用當年或隔年分離培養的菌種，也可用病田病葉的浸泡液。
采用培養的菌種時，則在使用前先將保存的菌種轉移在新的培養基上置26℃恒溫培養48-72小時備用。當年分離的菌株如系弱毒菌株，培養好后則可使用，如系強毒菌株，則需先經鈍化處理如連續轉管等，或可直接引入抗性材料，其目的是創造一個緩慢致死的條件，避免強毒菌株迅速殺死寄主。
制備病葉浸泡液時，可在病區，直接采摘足夠的病葉，切成1-2cm的小段，浸于冷開水中泡20分鐘，過濾后備用，浸泡液要隨泡隨用;病葉量不夠時，可先將病原菌接種在感病品種上，待葉片大量發病后再按上法浸制。
2、水稻秧苗的準備白葉枯病原菌誘發寄主水稻突變的處理時期以旬平均溫度24-31℃為宜，同時又應使誘變材料-水稻處于分蘗期，因此要因地制宜確定水稻的播種期，湖南以5月下旬-6月初播種為宜，秧田要注意稀播，培育壯秧，尤其要求秧苗根系健壯。
用于誘變處理的材料應根據育種目標選擇綜合性狀良好，只有少數性狀需進一步改良的品種，或具有特殊性狀和特殊用途的材料。
品種間存在遺傳保守性的差異，故M2代出現的突變頻率高低不一;通常陳年種子長成的植株遺傳保守性較弱，使用在干燥器內保存2-4年的種子易獲得嵌合體。
3、誘變處理操作(1)拔起苗床內生長健壯，根系發達，帶有1-2個分蘗的秧苗，洗盡泥土后，剝去其分蘗;用五束針(五根縫衣針捆扎而成)蘸濃度為3億個/ml的白葉枯病原菌的懸浮液穿刺生長點及四周(莖基部)1-2次，接種且形成5-10個對穿的孔洞，再將此秧苗浸入約3億個/ml病原菌的菌液內2-3小時(以淹沒傷口為準)，也可用醫用注射器將菌液一次注入莖基部生長點及四周。
(2)將經處理的秧苗在傍晚17∶00-18∶00氣溫下降后移植在觀察圃內，觀察圃的管理要使秧苗不曝曬或深淹秧苗，促進秧苗快返青，早恢復生長，尤其要注意促進地下部分的健壯發育。
4、M1代的培育和種子的選收經誘變因子處理后的植株移栽成活的即為M1代。
M1代培育是誘變成功與否的關鍵。處理的材料在移栽后半個月出現第一次感病高峰，病原菌殺死生長點及周圍分生組織的絕大部分，導致地上部分的凋萎死亡，然而殘存的小部分細胞再次發生分蘗，形成植株;此植株在第二次發病高峰期，地上部分又一次被殺死，第二次又重新長出分蘗形成植株，如此可重復若干次。
對M1代加強管理，就是促進盡可能多的植株在地上部分凋萎死亡后，能重新長出新的分蘗。
為節省人力、物力，提高誘變效率，在M1代收種時，可以淘汰未發病(O級)和發病輕度(Ⅰ級)的個體，而選留發病重(Ⅱ級)和嚴重(Ⅲ級)植株，供單株選收種子。
附生物誘變處理分級標準O級經誘變處理移栽成活后，不發病;或僅出現枯葉型，枯心型病狀;或只出現黃葉、花葉型病狀;不出現地上部分凋萎死亡。
Ⅰ級經誘變處理移栽成活后，地上部分全部凋萎死亡一次，再形成的植株并且生長茂盛。
Ⅱ級經誘變處理移栽成活后，地上部分經二次凋萎死亡，爾后再恢復生長。
Ⅲ級經誘變處理移栽成活后，地上部分經歷三次或三次以上的凋萎死亡，爾后恢復生長。
O級植株，經誘變處理后未發病或輕度發病，說明誘變因子的引入對其發生的作用甚微，產生突變的可能性極小，因此予以淘汰。
Ⅰ級植株，是因只經歷了一次地上部分的凋萎死亡，重新長出的分蘗可能是未經受病原菌殺傷的分生組織形成的，這些分蘗生活力強，生長快，很快形成優勢分蘗，而被誘變因子殺傷組織分生出來的分蘗生活力弱，生長十分緩慢，因此競爭能力差，最終被優勢分蘗排擠掉，產生突變的可能性相對較小。
Ⅱ級植株有兩次地上部分被徹底殺死，病原菌也經歷了較長時間的蔓延和擴展，生長點及周圍的組織絕大部分被殺死或殺傷，幸免者甚少。因而再生的植株大部分是經受了誘變因子作用的組織分生而成，產生突變的可能性較大。
Ⅲ級植株，其地上部分經歷了三次或三次以上徹底殺死過程，未經受病原菌殺死或殺傷的組織微乎其微，因而再生的植株產生突變的可能性大。
5、M2代的選擇M1代選收的單株種子，種植成M2代株系。
生物誘變處理的全過程在營養生長階段完成，部分突變細胞成為性細胞參與生殖，因此M2株系中會出現一定比例的突變體，突變頻率一般為百分之幾，有時也可達50%以上。
M2代出現的突變是多向性的，包括抗性、米質、產量、生育期、生長勢等特性和株高、葉型、色素、芒等特征。
多數情況下，M2出現的變異材料的基本綜合性狀不如親本，但在M3代往往分離出超親個體，因此M2代出現的突變體應盡量收種，並種植成M3。
在種植M2株系同時應種植親本作對照。
6、M3代的選擇在M3代中一般出現百分之幾的分離，有時還會分離出相對M2為顯性的性狀。在百分之幾的分離個體中易出現基本綜合性狀超過親本的優良單株，應特別注意選擇分離的M3株系，對M3的穩定部分和分離出的株系應給以必要的鑒定，對某些有價值和特殊用途的性狀予以保留或利用。
M3代以后的處理和雜交育種及物理、化學誘變育種相同。
7、誘變處理結果如下①1979年6月，用水稻白葉枯病菌處理水稻品種紅410的10個單株，秋后選收其中的兩個M1單株種子，80年種植成兩個M2株系，在其中一個株系的200個單株的群體中發現3株變異株。以該株系的未變異個體為對照，一個變異株的性狀表現為葉色深、葉片窄、谷粒較長;81年種植此變異株，株系中少數個體出現分離，主要特征是谷粒有芒，分別定名為B1和B1一芒。82年種植時，B1不再分離，B1一芒繼續分離。84年品比試驗時，B1的產量比親本紅410和湘矮早10號分別增產4.35%和6.38%，85年抗病試驗中B1高抗稻瘟病;該品系全生育期為110天，比親本早2-3天，株高80cm左右，莖桿細硬，葉鞘基部紫色，株型緊湊，葉片挺直，長寬適中，分蘗力強，不早衰，抗倒伏，農藝性狀優于親本。
B1和親本紅410比較，大部分性狀相同，35個性狀中有29個一致，但有幾個突出的可遺傳變異
Ⅰ谷粒特征B1谷粒長園筒形，長寬比為2.7，而親本紅410谷粒較短、較扁。
Ⅱ米質懸殊B1堊白面積8.7%，親本超過24%，蛋白質含量8.83%，米膠長度47mm，直鏈淀粉26%，B1米質顯著變優。
Ⅲ葉片差異B1葉色較親本深，葉片狹長，劍葉下第一葉長寬比值為27.32，紅410為22.02。
②84年用水稻白葉枯病菌處理閩晚6號，均于M2或M3代獲得了變異植株，頻率在1.08-1.64%之間，主要變異表現在抗性，形態特征和生育期;其中M2代一變異株表現為早熟(早15天)、抗病、葉短、莖細、色淡、谷粒長形等。M3代出現分離，比例為42∶1。
1986年止已在湘矮早9號、珍龍13、合江18和四豐43及上述二個品種，共6品種上成功地獲得了突變。
二、水稻稻瘟病菌誘發寄主水稻突變的程序基本與白葉枯病菌一致，其病原菌的準備是在當地第一次或第二次發病高峰期前后，從病葉的新鮮病斑上洗下梨形孢子配制成濃度為15-20孢子/視野(100X)的懸浮液，然后將懸浮液接種至處于分蘗始期的健壯秧苗的生長點及四周，接種后保溫20小時左右，以促進孢子萌發，再移栽于觀察病圃內;當氣候條件對M1代發病不利時，可用醫用注射器把孢子懸液注射于恢復旺盛生長的Ⅰ級M1植株，造成再度發病，以期獲得Ⅱ、Ⅲ級植株。對M1代的誘變需要一定的濕度條件，葉面露珠保持12小時左右，一般在重病區可滿足上述條件。
三、水稻黃矮病毒誘發寄主水稻突變的技術要點與上述二種病原相同，其接種是將飼毒并通過了循徊期的帶毒介體葉蟬放入籠罩，而該籠罩內有待誘變的、處于近分蘗期的秧苗，葉蟬把病毒引入處理材料后，即移栽秧苗，成活后在M1代中淘汰不發病的植株。誘變處理時期掌握在使發病峰期與分蘗盛期相吻合。
四、小麥赤霉病菌對寄主小麥的誘變，其方法與水稻稻瘟病菌和白葉枯病菌誘變寄主水稻的方法基本相同。用子囊孢子或切成小段的菌絲懸浮液，也可用分生孢子懸浮液，濃度為20個左右/視野(100X)，接種分蘗期的小麥生長點及四周，在26℃溫度條件下，保溫(濕度80-100%)20小時左右，以完成寄生關系的建立，然后移栽于觀察圃。誘變過程要在赤霉病流行期內完成，欲使小麥的分蘗期與赤霉病流行期吻合，須改小麥秋冬種為春播，因地制宜確定播種期，湖南地區可在2月初播種，3月上旬進行誘變處理。而冬性或半冬性小麥還應在播種前催芽并完成春化階段(低溫處理)。如當地赤霉病流行期短不足以完成誘變過程，則應采取相應的保濕措施。其余各程序同前述水稻的誘變處理。
實施本發明不需特殊的設備，而且所需的土地面積，以獲得同樣數量的正突變體計算，只是輻射誘變的1/10左右;對工作人員絕對安全，也不污染環境;技術簡單，操作容易，只要稍具植物病理和育種知識的工作人員即可勝任此項工作;誘變效應顯著，誘變譜廣，包括抗性、豐產性、品質和其他多種農藝性狀，正突變頻率高出物理、化學誘變，一般可達百分之幾以上，並且在突變后代中易出現超親個體，本發明廣泛實施，可以大大加速有價值的原始材料的創造，為培育人們所需的品種開拓了一個有效的途徑。
權利要求
1.一種誘導作物性狀變異的生物誘變技術，即把病原微生物引入另一生物誘發突變，本發明的特征為在適宜的溫濕度條件下，在寄主作物的營養生長時期，將生物誘變因子-植物病原引入寄主作物植株的生長點及其四周，使之產生較高頻率的性狀變異，然后在經誘變處理的M1代淘汰未發病(O級)和輕度發病(Ⅰ級)的個體，選留發病重(Ⅱ級)和嚴重(Ⅲ級)的植株，再在M2代中選擇變異體，以創造有價值的育種材料。
2.由權利要求
1所述的生物誘變技術，其特征為作生物誘變因子的植物病原有真菌性病原菌，細菌性病原菌和病毒性病原等。
3.由權利要求
1或2所述的生物誘變技術，其特征為作為生物誘變因子的真菌性病原菌和細菌性病原菌的制備，可直接獲取作物感病部位的病原菌制成懸浮液，也可用當年或隔年分離培養的病原菌。
4.由權利要求
3所述的生物誘變技術，其特征為以當年分離的強毒菌株作誘變因子時，則需鈍化處理或直接引入抗性材料。
5.由權利要求
1所述的生物誘變技術，其特征為生物誘變處理的適宜溫濕度應選擇在一個使病原導致寄主緩慢致死的范圍內。
6.由權利要求
1所述的生物誘變技術，其特征為生物誘變因子的處理劑量應既能使病原接種上寄主材料，又要使發病過程的潛伏期盡可能延長。
專利摘要
生物誘變技術涉及使用誘變因子誘導植物產生突變，改良基因型。本發明使用植物病原作生物誘變因子，在適宜的溫濕度條件下，在寄主作物的營養生長時期內，將一定濃度的生物誘變因子通過適當的方法引入寄主作物的生長點及四周，使之產生較高頻率的性狀變異，再經選擇的方法培育出人們所需的品種。本技術經濟有效，簡單易行，安全可靠，既不需要特殊的設備條件，又不污染環境，突變頻率高于物理、化學誘變。
文檔編號A01H1/06GK87102015SQ87102015
公開日1988年10月26日 申請日期1987年4月16日
發明者黃河清 申請人:湖南省植物保護研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan