專利名稱：天然抑芽劑的制備方法及其在烤煙腋芽抑制上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然抑芽劑的制備方法及其在烤煙腋芽抑制上的應用，屬于生物技術領域。尤其是天然脫落酸S-(+)-ABA，簡稱ABA，5-(1-羥基-2，-6，6-三甲基-4-氧代-2-環己烯-1-基)-3-甲基-2-順-4-反-戊二烯酸，及Botcinolide，即4-羥基-2-辛炔酸，兩種產品均是Botrytis cinerea PersrCGMCC NO.0357-1、NO.0357-2真菌的代謝產物(保藏日為1998年9月3日)。
煙葉在我國許多省份種植面積大、經濟效益明顯。但每年田間管理中的封頂打杈，極其勞累費力，且摘除后不長時間，又會長出新的杈芽。為了提高煙葉產品產量、質量及減少勞力，國家先后從國外購入抑芽用的Flumetralin(抑芽敏)、Maleichydrazide(抑芽丹、芽敵)、除芽通等，這些藥品用于田間管理，抑芽效果各有特色，但價格較高(13元/畝)，而且它們都是有機合成制劑，對烤煙品質的影響及殘留毒性、環境污染等問題尚未得到解決。
本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足及弊端，提供一種安全無毒、無副作用、不污染環境、無殘毒顧慮、效高價廉的新型抑芽劑。
上述目的是這樣實現的從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害標本，選擇新鮮癥狀典型的標本，進行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進行單孢分離、純化培養，然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔生物活性強，產率高的株系(產率在0.8‰以上，小麥抑芽快速檢測試驗，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復比較篩選出高產菌株，產率0.9‰～1.5‰，最后依序編號，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存備用。培養基為PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培養7天，然后加入溶劑萃取、過濾、濃縮干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱內保存備用。將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行快速生測篩選，將預先提取待測粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml分別移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26℃溫箱中培養5～7天，篩選出活性強，產率高的菌株，培養所得粗品天然脫落酸(ABA)。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應用IRV、UV、MS，結合HNMR儀器解析，確定分子量和結構式，天然脫落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，結構式為
為了避免原料浪費，將萃取后的剩余水溶液再作處理。方法是萃取后的剩余水溶液調整PH為堿性，經EtOAC抽提分離出溶劑層和水層，再對水層調整PH值，經倍量溶劑抽提，再次分離出溶劑層和水層，棄去水層，將此次分離出來的溶劑收集，用水和飽和Nacl液洗后，無水Na2So4脫水，濃縮干燥，EtOAC可溶酸性餾份，得到天然脫落酸ABA。
天然脫落酸的分子量為264.3，分子式C15H20O4。該物質結構具有5個特點①主核具有環狀結構；②環狀結構上必須有雙鍵③主核具有一個側鏈；④具有一個-COOH，羧基和主核間至少有一碳原子⑤主核和側鏈必須具立體結構。
另一種制備方法是從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害標本，選擇新鮮癥狀典型的標本，進行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進行單孢分離、純化培養，然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔生物活性強產率高的株系(產率在0.8‰以上，小麥抑芽快速檢測試驗，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復比較選出高產菌株，產率0.9‰～1.5‰，最后依序編號，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存備用。培養基為PDA，室溫培養12天(如用谷糠23℃培養6天)然后加入溶劑萃取、過濾、濃縮干燥得Botcinolide的粗抽品，放在-80℃冰箱內保存備用。將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行快速生測篩選，將預先提取的待測粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26℃溫箱中培養5～7天，篩選出活性強產率高的菌株來生產天然Botcinolide。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應用IRV、UV、MS，結合HNMR儀器解析，確定分子量和結構式，分子量是338，分子式C20H34O8，結構式為
將天然抑芽劑用于烤煙栽培過程的腋芽抑制上，采用涂抹或噴淋方式，達到了抑制煙芽瘋長，收到了良好的效果。該抑芽劑也可用于其他植物的封頂打杈。花卉、蔬菜保鮮，調控作物生育，改善品質提高產量等。
天然抑芽劑由于是從植物中采集、分離、培養、萃取、過濾、干燥而得，整個加工過程安全無毒，不含有機合成成份，因而不污染環境、無殘毒，生產成本低，價格便宜，每畝成本僅需8～9元，又能增進烤煙品質，抑芽效果平均在90％以上。該抑芽劑也可用于其他植物的封頂打杈。花卉、蔬菜保鮮，調控作物生育，改善品質提高產量等。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳述
圖1為天然抑芽劑的制備方法工藝流程2為天然脫落酸ABA剩余水溶液的抽提工藝流程3為天然抑芽劑(抑1、抑2)與對照組在田間應用示意圖首先從自然界各種植物(果樹、蔬菜、花卉、糧食、經濟作物、野生林木……等)中采集Botrytis Cinere Persr的真菌病害標本，然后選擇新鮮、癥狀典型的標本，進行表面消毒，用滅菌水沖洗，進行單孢分離、純化培養，采用小麥抑芽試驗法，篩選具有生物活性的菌株，再從有活性的菌株群中反復篩選比較，尋找活性物質產出率最高的菌株作為菌種保存。例如，我們從萵苣、蔥、草莓、酸木瓜等植物的灰霉病中分離到的7個菌株，按照前述方法分離培養、萃取、濃縮，即可得到粗產品，提供生測試驗。培養基為PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培養7天，然后加入溶劑萃取、過濾、濃縮干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱內保存備用。將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行快速生測篩選，將預先配制好的標準及待測粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26℃溫箱中培養5～7天，篩選出活性強產率高的天然脫落酸(ABA)。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應用IRV、UV、MS，結合HNMR儀器解析、分子量和結構式，天然脫落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，結構式為
為了避免原料浪費，將萃取后的剩余水溶液再作處理。方法是萃取后的剩余水溶液調整PH為堿性，經EtOAC抽提分離出溶劑層和水層，再對水層調整PH值，經倍量溶劑抽提，再次分離出溶劑層和水層，棄去水層，將此次分離出來的溶劑收集，用水和飽和Nacl液洗后，無水Na2So4脫水，濃縮干燥，EtOAC可溶酸性餾份，得到天然脫落酸ABA。
另一種制備方法是將篩選出來產率高的菌種，用PDA培養基，室溫培養12天，如果用谷糠作培養基，23℃培養6天，然后用倍量乙酸乙脂浸提24小時(注意振搖)，過濾、濃縮，再用苯浸提濃縮，即得到天然抑芽劑Botcinolide。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應用IRV、UV、MS，結合HNMR儀器解析，確定分子量和結構式，分子量是338，分子式C20H34O8，結構式為
用這兩種方法制備出的天然抑芽劑用于烤煙腋芽的抑制上。采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行快速生測篩選。方法是取精選小麥種子(汰除病損，空癟)預浸1/1000多菌靈懸浮液內吸濕處理24小時。取滅菌燒杯(高6cm，徑4.5cm)若干，杯底各放入小玻球40粒，其上墊一層滅菌圓形濾紙片，紙上再均布小麥種子10粒。分別將預先配制好的標準及待測粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入燒杯中，以剛好浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復4次，置26℃溫箱中培養5～7天，觀測幼根、幼芽生長有無抑制現象，而初步判斷抽提粗品中是否含有活性成份。如前所述，產品先經室內生測鑒定，證明活性很高，再經室內盆栽煙株抑芽初試，效果明顯，最后進行多點田間小區試驗，98年6月下旬～7月下旬，在我省尋甸縣、陸良縣、彌勒縣分別選擇生長整齊，高矮一致，品種相同，管理一樣的煙田，(最好選紅花大金元或V-2系列品種)正常封頂打杈后，待腋芽剛露尖約1公分長，按田間布置圖劃分試驗小區。試驗藥劑ABA(抑1)、Botcinolide(抑2)、抑芽敏、除芽通、芽敵。按照試驗設計，分別稱取一定量的各供試藥劑，加水充分攪拌均勻，調制成所需濃度，ABA(抑1)稀釋成100、200、300倍；Botcinolide(抑2)稀釋成100、200倍；抑芽敏(有效成分25.5％)300倍；除芽通(有效成分33％)100倍；芽敵(有效成分30.2％)50倍；清水對照。共九個處理，四次重復，總計36個小區，每小區0.03畝，同田隨機區組排列。選擇晴天無雨日期，于當天下午5時后，用杯淋法或涂抹法施藥到各小區煙株腋芽上，處理后定點掛牌觀察記載，抑芽效果90～92％，每畝成本僅需8～9元。而國內推廣使用的有機合成抑芽敏、芽敵、除芽通等，每畝成本13元，抑芽效果雖都達到89～92％，但對環境污染及殘毒尚未解決，就抑芽作用來說，天然抑芽劑作為新型抑芽劑是有競爭力的，采用涂抹每畝僅需10克，采用噴灑每畝20克，價錢也較便宜。該抑芽劑也可用于其他植物的封頂打杈。花卉、蔬菜保鮮，調控作物生育，改善品質提高產量等。
權利要求
1.一種天然抑芽劑的制備方法，其特征在于a、從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO.0357-1的病害標本，選擇新鮮癥狀典型的標本，進行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進行單孢分離、純化培養，然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔生物活性強產率高的株系(產率在0.8％以上，小麥抑芽快速檢測試驗，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復比較選出高產菌株，產率0.9‰～1.5‰，最后依序編號，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存備用。b、培養基為PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培養7天，然后加入溶劑萃取、過濾、濃縮干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱內保存備用，c、將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行快速生測篩選，將預先配制好的標準ABA液及待測粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml分別移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26℃溫箱中培養5～7天，篩選出活性強，產率高的菌株培養所得粗品天然脫落酸(ABA)，d、再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應用IRV、UV、MS，結合HNMR儀器解析，確定分子量和結構式，天然脫落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，結構式為
2.一種天然抑芽劑的制備方法，其特征在于a、從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO.0357-2的病害標本，選擇新鮮癥狀典型的標本，進行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進行單孢分離、純化培養，然后按照室內菌株篩選及生產工藝流程方法，選拔生物活性強產率高的株系(產率在0.8％以上，小麥抑芽快速檢測試驗，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復比較選出高產菌株，產率0.9‰～1.5‰，最后依序編號，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存備用，b、培養基為PDA，室溫培養12天(如用谷糠23℃培養6天)然后加入溶劑萃取、過濾、濃縮干燥得Botcinolide的粗抽品，放在一80℃冰箱內保存備用，c、將所得產物采用抑制小麥胚芽鞘生長法，進行快速生測篩選，將預先提取的待測粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入放有處理過的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒種子為宜，對照用清水，每一濃度重復3次，置26℃溫箱中培養5～7天，篩選出活性強產率高的菌株來生產天然Botcinolide，d、再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應用IRV、UV、MS，結合HNMR儀器解析，確定分子量和結構式，分子量是338，分子式C20H34O8，結構式為
3.據權利要求1或2所述的天然抑芽劑，用于烤煙腋芽抑制上。
4.據權利要求1所述和制備方法，其特征在于萃取后的剩余水溶液調整PH為堿性，經EtOAC抽提分離出溶劑層和水層，再對水層調整PH值，經倍量溶劑抽提，再次分離出溶劑層和水層，棄去水層，將此次分離出來的溶劑收集，用水和飽和Nacl液洗后，無水Na2So4脫水，濃縮干燥，EtOAC處理得可溶酸性餾份，得到天然脫落酸ABA。
全文摘要
本發明公開了用于烤煙腋芽抑制的天然抑芽劑,從植物中采集、分離、純化培養,選拔生物活性強,產率高的株系,進行小麥抑芽快速檢測,再反復比較篩選出高產菌株,再經培養、溶劑萃取、濃縮、干燥而得天然脫落酸(ABA)和Botcinolide兩種抑芽劑。將其用于烤煙腋芽的抑制上,有效率達89～92%,整個加工過程安全無毒,不含有機合成成份,因而不污染環境、無殘毒,生產成本低,價格便宜,也可用于花卉、蔬菜保鮮,調控作物生育,改善品質提高產量等。
文檔編號A01N63/02GK1254508SQ9812274
公開日2000年5月31日 申請日期1998年11月21日 優先權日1998年11月21日
發明者沈嘉祥, 陳志 申請人:昆明恒溢隆經貿有限責任公司