專利名稱：抗腫瘤藥和殺蟲劑總番荔素及其制造方法
技術領域：
本發明涉及從番荔枝科(Annonaceae)植物番荔枝(Annona squamosa)種子中提取的總活性成分總番荔素(Annonaceous acetogenins或polyketids)，用于制造抗腫瘤藥物和農用或家用殺蟲劑。
番荔枝是我國南方熱帶和亞熱帶地區產的一種藥用植物，其果實是食用水果。番荔枝科中若干屬植物含有一類抗腫瘤和殺蟲活性很強的長碳鏈脂肪酸內酯類的天然化合物，即番荔素。從1982年報道第一個番荔素至今，已發現的類似物超過260個。但至今仍停留在化學結構、類似物合成和生物活性等方面的研究。由于每種植物所含的番荔素同系列化合物品種繁多，如從番荔枝已發現40多個同系物，各同系物的理化性質十分近似，分離較困難，并且單個化合物的含量相對較低，要積累純的單體化合物供活性研究，藥效評價和開發抗腫瘤新藥或殺蟲劑，其難度都較大。盡管經各國科學家多年研究，發現結構各異的番荔素業已超過260個，并測定了它們在體外的生理活性以及其中少數化合物在體內活性。番荔素的分子結構中有多個手性碳原子，用化學合成方法去開擴藥源亦非易事。因此，無論從植物中分離或用化學方法合成單體番荔素，距離實際應用階段尚有一段較長的距離。
本發明的目的是從番荔枝種子提取總活性成分總番荔素，以總有效成分代替單一有效成分制造抗腫瘤藥物以及農用或家用殺蟲劑。由于本專利以資源豐富易得的植物為原料，又采用較簡單的制造工藝，降低了生產成本，有利于實用的目的。
本發明主要內容和要點一．化學與藥學部分總番荔素提取與富集將番荔枝種子破碎成粗粉，溫室下，以己烷或石油醚浸泡脫脂，揮去溶劑后，繼以95％的乙醇(甲醇、丙醇、異丙醇或丙酮)滲漉，減壓回收溶劑得醇提取物，在水溶液中以氯仿(二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚或乙酸乙酯)分配處理，番荔素為氯仿萃取提出，再以90％乙醇(甲醇、丙醇或異丙醇)己烷(或石油醚)分配處理氯仿提取物，最后將90％乙醇提取物以硅膠吸附層析，氯仿(二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚或乙酸乙酯)-甲醇(98∶2～90∶10)洗脫，收集最先洗出部分(～70％)，可使總番荔素含量富集至90％，其工藝流程見(圖1)。番荔素的質量控制方法1．比色法測定總番荔素含量本法基于番荔素的分子中含有一個α,β-不飽和-γ-內酯環，在乙醇溶液中能與3,5-二硝基苯甲酸(2％)和氫氧化鈉(5％)乙醇試劑顯示桃紅色反應，置可見光分光光度計中，530nm下測定吸收度，計算含量。回歸方程y=0.4048x-1.097×10-3線性范圍0.07-0.30mg r=0.9999(相關系數)表-1比色法測定各提取物中的總番荔素含量
*數據為測量多次平的均值2．高效液相色譜法測定主要番荔素的含量采用C-18烷基鍵合硅膠柱(4.5mm×25cm)，甲醇∶水(8∶2)為流動相，流速1ml/分，在高效液相色譜儀，檢測波長220 nm，測量各成分的吸收度，結果如下表-2高效液相色譜法測定總番荔素中主要番荔素的含量
高效液相色譜分離圖見附圖2二．藥理學部分1．總蕃荔素的急性毒性實驗小鼠半數致死量LD50值測定結果如下腹腔注射ip×1 LD50=6.11±0.10mg/kg靜脈注射iv×1 LD50=3.89±0.10mg/kg口服po×1 LD50=82.98±5.40mg/kg總蕃荔素的LD50值與目前臨床應用的一些抗腫瘤藥物如長春新堿(VCR)相近。在敏感劑量區量-效(死亡)關系非常明顯。三種給藥途徑中以口服毒性反應最小。腹腔注射給藥后吸收很快，高劑量死亡時間集中在2小時內，低劑量集中于8小時內，若24～48小時內動物能夠存活，就基本不會死亡，說明藥物在體內的吸收，轉化或排出較快。
2．總番荔素體外抗腫瘤作用體外對人肝癌細胞Bel、人結腸癌細胞HCT-8、人卵巢癌細胞A2780、人口腔上皮癌細胞KB及其耐藥細胞株KBv-200、人宮頸癌細胞HeLa S3、中國倉鼠肺纖維瘤細胞V79和小鼠母纖維瘤細胞L729，進行了抑制腫瘤生長實驗，結果表明對人肝癌，人結腸癌，人卵巢癌抑癌活性最強；對人口腔上皮癌及其耐藥株KBv-200具有同等的藥效，說明總番荔素沒有一般抗癌藥物存在的易產生多藥耐藥性(MDR)的缺點。見表3,4,5和6。
表-3．總番荔素對五種人癌細胞株的殺傷活性(ED50半數有效劑量
*5-Fu陽性對照藥5-氟尿嘧啶藥表-4．總番荔素對四種人癌細胞培養生長的抑制作用(表中數據為抑制率％
表-5．總番荔素對人肝癌Bel細胞培養生長的抑制作用(表中數據為抑制率％)<
表-6．總番荔素對三種癌細胞培養生長的抑制作用*(表中數據為抑制率％)<
ADM陽性對照藥-阿霉素3．總番荔素體內對動物移植性腫瘤生長的抑制作用以小鼠肝癌H22、小鼠黑色素瘤B16、小鼠肉瘤S180、小鼠子宮頸癌U14、小鼠艾氏癌實體瘤ESC和小鼠路易斯(Lewis)肺癌等6種動物移植性腫瘤細胞株進行體內抑瘤生長試驗。總番荔素設三個劑量組，另設對照組(給溶解樣品的相同溶劑)和環磷酸胺(CTX)陽性對照組，各組連續口服給藥10～11天，結果表明總番荔素對小鼠肝癌H22的活性最強，其次為黑色素瘤B16和子宮頸癌U14。表明總蕃荔素有一定的毒性靶組織和器官。
表-7．總番荔素口服給藥對小鼠移植性肝癌H22的抑瘤作用
*對照組給相同量溶解樣品的溶劑，下同表-8．總番荔素口服給藥對小鼠黑色素瘤B16的抑瘤作用
表-9．總番荔素口服給藥對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用
表-10．總番荔素口服給藥對小鼠移植性子宮頸癌U14的抑瘤作用
表-11．總番荔素口服給藥對小鼠艾氏癌實體瘤ESC的抑瘤活性
表-12．總蕃荔素口服給藥對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
表13．總番荔素殺蟲，殺螨生物活性試驗
4．特殊毒理學實驗 總番荔素只在劑量較高時方出現致突變作用(Ames實驗)和微核計數呈輕度陽性反應，表明本藥的致誘變作用較輕，與多數抗癌藥有所不同。
5．一般藥理學實驗本藥在0.03-0.1mg/kg,iv劑量下對犬的呼吸頻率、幅度、心律、心率和心電圖均無影響；對小鼠的一般活動無計數差異，只在0.34mg/kg iv時，對小鼠有較輕的興奮作用。
本發明的優點和效果是從番荔枝種子提取總活性成分番荔素，以總有效成分代替單一有效成分制造抗腫瘤藥物以及農用或家用殺蟲劑，不僅能夠集中顯示各單一有效成分的特點，而且還可提高總活性成分的含量。與此同時，由于以資源豐富易得的植物為原料，又采用較簡單的制造工藝，降低了生產成本，有利于實際應用。
圖1總番荔素工藝流程2高效液相色譜分離圖其中(1)-番荔辛(2)-中心番荔辛(3)-番荔亭E (4)-番荔亭B1儀器Waters高效液相色譜儀486紫外檢測器檢測波長220nm
權利要求
1．抗腫瘤藥和殺蟲劑總番荔素及其制造方法，其特征包括以下步驟(1)．用有機溶劑從番荔枝種子提取總的有效成分總番荔素；(2)．用光電比色法測定制品中的總番荔素含量，用高效液相色譜法測定總番荔素中四個主要有效成分的含量；(3)．通過體外腫瘤細胞培養和體內抑瘤動物實驗，測定制品的抗腫瘤活性；通過噴霧法、藥膜法和浸葉法測定制品的殺蟲作用。
2．按照權利要求1所述的抗腫瘤藥和殺蟲劑總番荔素及其制造方法，其特征是番荔枝種子先用己烷脫脂，然后用醇滲漉、氯仿萃取以及己烷-90％乙醇分配處理，取90％乙醇部分，最后再經硅膠吸附層析，氯仿-甲醇洗脫，可得到有效物質總番荔素含量達到90％。
3．按照權利要求1所述的抗腫瘤藥和殺蟲劑總番荔素及其制造方法，其特征是用光電比色法，在乙醇溶液中加入3,5-二硝基苯甲酸和氫氧化鈉試劑顯示桃紅色反應，在530nm測定吸收度，計算總番荔素含量；用高效液相色譜法，采用C-18鍵合硅膠柱，甲醇-水(80∶20)為流動相，220nm下測定番荔辛、牛心番荔辛、番荔亭-E和番荔亭-B1的含量。
4．按照權利要求1所述的抗腫瘤藥和殺蟲劑總番荔素及其制造方法，其特征是用6種人癌和2種動物腫瘤細胞株進行體外培養，測定制品的半數有效劑量(ED50)及抑制率(％)用6種動物移植性腫瘤進行體內抑瘤活性試驗；采用藥膜法、噴霧法或浸葉法測定對8種害蟲的殺滅率(％)。
全文摘要
本發明涉及一種用番荔枝種子為原料提取其總有效成分總番荔素,用于制造骯腫瘤藥和殺蟲劑,其工藝是用已烷脫脂,用醇滲漉,氯仿萃取以及已烷90%－乙醇分配處理,再經硅膠吸附層析,氯仿－甲醇洗脫得到成品,經藥效學實驗證明,對肝癌、結腸癌、卵巢癌等有很強的抑制作用,對多種害蟲亦有殺滅作用,本制品原料豐富,工藝簡單,總有效成分含量很高,成本較低,適于推廣應用。
文檔編號A01N43/02GK1224016SQ9810136
公開日1999年7月28日 申請日期1998年4月10日 優先權日1998年4月10日
發明者余競光, 王德昌, 羅秀珍, 王永泉, 孫蘭 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所