專利名稱：飼料酶制品的制作方法
技術領域：
本發明涉及顆粒狀的含酶制品〔如顆粒形式的制品(下文常簡稱為“顆粒”)〕，當所述酶適用于作為動物飼料的成份時，它特別適用于摻入動物飼料組合物中，特別是配制成小丸(“丸化的”)的動物飼料組合物或類似物。當使用在工業上常優選用于這類組合物的生產條件，如蒸汽制丸時，本發明使得生產酶活性保留程度極高的組合物成為可能。
已證明將某些類型的酶，例如β-葡聚糖酶，木聚糖酶或植酸酶摻入動物飼料組合物中可對改善有關動物從飼料中吸收營養成份或礦物質具有明顯有利的影響。在飼料生產工業中，由于各種各樣的原因優選以小丸形式配制的動物飼料組合物，包括易于處理和定量；處理期間低水平的粉末形成及易于被動物消化。
優選小丸狀配制品的另一個重要的原因在于制丸過程本身有利于對飼料進行熱處理，以便如清除致病性微生物，如沙門氏菌屬種類、李斯特氏菌屬種類、彎曲桿菌屬種類等；例如，為了有效清除沙門氏菌屬種類，飼料在制丸過程中必須在至少大約81℃的溫度下熱處理。在制丸過程中借助于如對飼料的蒸汽處理非常適用于實現該熱處理。
盡管由于上述原因對飼料的熱處理是重要的，但很明顯該處理，特別是涉及使飼料成份暴露于熱和水汽中的使用水蒸汽的處理一般可預料到對于存在于待處理的該組合物中的酶具有有害(滅活或變性)影響。在這一點上以舉例的方式提到下列文獻(I)Novo Nordisk出版物A-06293(可從丹麥Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，獲得)，它給出了組合物制丸時酶穩定性的數據，其中酶分別為含來自Humicola insolens的木聚糖酶和β-葡聚糖酶，來自枯草芽孢桿菌的淀粉酶及來自地衣形芽孢桿菌的蛋白酶的包被顆粒的形式。據報道在每種情況下蒸汽加熱到85℃導致喪失大約25％的起始酶活性。
(ii)Novo Nordisk產品目錄號B402e-GB(可從丹麥Novo NordiskA/S，Bagsvaerd，獲得)，它報道了稱為Bio-FeedTMPlus CT〔含經過Humicola insolens浸沒發酵生產的糖酶制品(Bio-FeedTMPlus)〕的包被的酶顆粒在飼料成份(包含該酶顆粒)加熱到83℃的飼料制丸過程中保留超過75％的酶活性。
(iii)EP 0569468 B1公開了(見其中實施例1)其中稱為“Bio-FeedPlus T”〔后者是所謂的“T-顆粒”型顆粒，即，根據US4106991生產的顆粒，除了酶外，它特別包含2-40％w/w的精細斷裂的纖維素纖維〕的顆粒狀酶制品的包被形式作為飼料組合物的成份摻入并對其進行涉及70℃溫度和直接蒸汽注入且持續25-30秒的制丸程序時，保留其90-100％的原始真菌β-葡聚糖酶活性。相反，未包被的T-顆粒及不屬于T-顆粒型的包被的“Bio-Feed Plus”顆粒均表現出保留較低(75％)的真菌β-葡聚糖酶活性。
人們熟知不同的酶可具有廣泛不同的特征，特別是對于其熱穩定性，例如其耐受相當高的溫度的能力。而且，本發明人的經驗是包被T-顆粒型含酶顆粒(見上)根據該顆粒中非酶組份的特性和含量可表現出廣泛不同的穩定性(特別是熱穩定性，例如，制丸過程中的穩定性)，對于包被T-顆粒型以外的含酶顆粒也是如此。
因此本發明的根本目的是獲得特定形式的在動物飼料生產工業中所用的加工過程(例如，制丸過程)中的加熱和蒸汽條件下(如在上面簡單列出的那些條件下)具有高穩定性的酶制劑，例如含酶顆粒。
本發明人驚奇地發現經過在顆粒狀的含酶配制品中包含適當比例的(i)疏水物質，特別是當一些或全部疏水物質(舉例來說，它可以是蠟質物質或諸如牛脂的脂肪物質)存在于包裹顆粒含酶核心的包被層中時，和(ii)不溶于水的物質(包括上述疏水物質)可實現在上述制丸條件下明顯增加顆粒狀含酶制品(例如，顆粒)的酶活性的保留。
因此，本發明的第一方面涉及一種顆粒狀的含酶制品(例如，一種顆粒)，包含共占至少1％重量(w/w)的一種或多種疏水物質；及共占至少75％w/w的包括該疏水物質的一種或多種不溶于水的物質。
優選疏水物質構成含酶制品的至少5％w/w，更優選為至少大約8％w/w。不溶于水的物質優選構成至少80％w/w，更優選至少85％w/w，例如至少90％的含酶制品。
所述的重量百分數以成品總重量為基礎(即，包括例如可能存在的任何包被層)。
在本發明的未包被制品中，一般優選疏水物質基本上均勻地分布于制品顆粒的物質中(或至少分布于取自制品的典型顆粒物質中)。該制品中疏水物質的適宜含量是在5-95％w/w的范圍內。在某些情況下，甚至高到大約98％w/w的疏水物質的含量也可適合于這類顆粒狀含酶制品。
如上所述，優選的本發明顆粒狀含酶制品包括(a)含酶核心，(b)含疏水物質并包圍或包裹含酶核心的包被層。在該制品中，疏水物質構成制品的1到50％w/w，常常是從5到25％w/w，更典型地是5到15％w/w。
在本發明的含酶制品的說明中所用的術語“顆粒”指包括任何形狀或形式的顆粒，如具有某種基本上規則(如球形)的幾何形狀的顆粒，不規則形狀的顆粒，或呈規則或不規則薄片形式的顆粒以及具有不同形狀或形式的顆粒混合物(如下文提到的顆粒類型的混合物)。
酶在本說明書及權利要求書中提及的酶分類號(EC號)按照生化和分子生物學國際協會命名委員會的推薦(1992)，學術出版公司，1992。
本發明含酶制品中的酶可以是任何形式的酶，特別是與動物飼料組合物有關的任何形式的酶。因此，例如，該酶可選自植酸酶〔特別是3-植酸酶(即，肌醇-六磷酸3-磷酸水解酶；分類為EC3.1.3.8)或6-植酸酶(即，肌醇-六磷酸6-磷酸水解酶；分類為EC3.1.3.26)〕，磷酸酶(例如，分類為EC3.1.3.1或EC3.1.3.2的酶)，木聚糖酶(例如，分類為EC3.2.1.8或EC3.2.1.32酶)，β-葡聚糖酶(例如，分類為EC3.2.1.75，EC3.2.1.71，EC3.2.1.59.或EC3.2.1.39的酶)，β-半乳聚糖酶〔例如，分類為EC3.2.1.89(1.4-β-半乳聚糖內切酶)或EC3.2.1.90(1，3-β-半乳聚糖內切酶)的酶〕，α-半乳糖苷酶(例如，分類為EC3.2.1.22的酶)，β-半乳糖苷酶〔例如，分類為EC3.2.1.23的酶(乳糖酶)〕，α-淀粉酶(EC3.1.1.1)，β-淀粉酶(EC3.2.1.2)，纖維素酶(例如，分類為EC3.2.1.4的酶)，果膠酶(分類為EC3.2.1.15的酶)和肽酶(EC3.4)，包括“蛋白質酶”或“蛋白酶”，如分類為EC3.4.21的酶。
從上面的描述已經清楚，可將一種或多種不同的酶摻入本發明的顆粒狀含酶制品中。本發明的含酶制品顆粒中酶成份在顆粒內的分布似乎是不重要的。因此，該酶成份可均勻或不均勻地分布于給定的顆粒物質中。
如果是包被的顆粒，顆粒的酶成份基本上局限于顆粒的核心，但應認識到至少一些酶成份可存在于包被層中。
在本發明的顆粒狀含酶制品中的酶蛋白質含量一般范圍為0.01-10％重量，如占制品的0.1-10％重(w/w)，更典型地是0.2-5％w/w，通常是0.3-2.5％w/w。酶含量較大程度取決于存在于顆粒狀制品中的酶性質。顆粒狀制品也可含有來自酶生產過程的其它物質，在工業上優選的實施方案是一般采用不完全純化的酶制品用于摻入顆粒制品中。
顆粒正如在某種程度上已說明的(見上文)，本發明的顆粒狀含酶制品非常適于是顆粒(即，顆粒化形式)，如“T-顆粒”(見上文)或一些其它類型的顆粒。或者，本發明的顆粒狀含酶制品的顆粒可以是如含有適當比例的作為酶和其它成份之基質的可熔成份的顆粒，可熔成份例如為棕櫚油(和/或其它可熔性植物油或脂肪)，氫化棕櫚油(和/或其它氫化植物油)，牛脂，氫化牛脂或蠟，。在這類顆粒的生產中，該制品的酶和其它有關成份導入融化的可熔成份中，且在顆粒形成條件下使該融化物固化。
至于本發明的顆粒狀含酶制品中顆粒的大小，考慮到為了有利于與飼料的其它成份充分混合且保證最終飼料產物中酶分布足夠均勻，待摻入飼料組合物中的制品的大多數顆粒的顆粒大小的可行上限一般是大約2mm。
在本說明書中，顆粒的大小可看作是顆粒的最大線型尺寸，因此，例如，如果基本上是球形的顆粒(如基本上是球形的粒狀顆粒)，所述顆粒大小可以是該顆粒的直徑。
本發明的含酶制品顆粒大小的下限一般主要由在該制品的生產和處理期間避免形成粉塵的需要來確定。該顆粒大小的可行下限常常是大約0.1mm。
疏水物質本發明說明書中所用的術語“疏水物質”指不容易被水濕潤的物質，即，它傾向于排斥水。該物質(其例子為油，脂肪，烴蠟和許多類型的樹脂)一般本質上完全不溶于水。
在本說明書中特別相關的疏水物質一般是可溶于烴類有機溶劑(例如，己烷，庚烷等)或氯代烴類有機溶劑(例如，二氯甲烷，氯仿等)的物質。其合適的例子包括各種甘油酯(即，甘油單酯，二酯或三酯)，如動物脂(例如，牛脂或羊脂)和植物油及其某些衍生物。
特別適用的疏水物質是那些在環境溫度下為固體且具有大約40℃或以上熔點的物質。其例子包括諸如某些天然或硬化(氫化)植物油或脂肪，例如，氫化棕櫚油，氫化棕櫚核油或氫化大豆油的物質以及諸如氫化動物脂(例如，氫化牛脂或羊脂)的物質。
一般適于測定本發明顆粒狀含酶制品中的疏水物質(如本文所限定的)總含量且利用二氯甲烷和正己烷提取的測定程序在本文材料和方法部分描述(見下文)。
不溶于水的物質本發明說明書中所用的術語“不溶于水的物質”包括從基本上完全不溶于水的那些物質到那些在水中表現出相當低度的溶解性(如，所說的溶解度為每100ml純水最多大約為1g)的物質范圍。因此，在本發明的說明書中不溶于水的物質包括但不限于如上限定的疏水物質。與本發明有關的其它類型不溶于水的物質包括各種無機鹽(例如，碳酸鈣，硫酸鈣，磷酸氫鈣，碳酸鎂)，包括硅酸鋁(例如，粘土，如高嶺土，皂土或漂白土)的礦物質，惰性金屬氧化物(例如，二氧化鈦或氧化鎂)，各種大分子物質〔例如，多糖，如纖維素或某些類型的淀粉，以及磨細的谷物或谷類粉(例如，從諸如小麥，大麥，黑麥的谷類生產的)或大豆(例如，大豆粗制粉或大豆面粉)〕和活性碳。
一般適于測定根據本發明的顆粒狀含酶制品中不溶于水的物質(如本文所限定的)總含量的測定程序在本文材料和方法部分(見下文)描述。
本發明的其它方面本發明還涉及生產含酶動物飼料組合物的方法，其中對與最終飼料組合物的其它成份混合的本發明的含酶制品進行蒸汽加熱步驟(如通常涉及上面列出的制丸程序，其中最終飼料組合物成丸)。
本發明的另一方面涉及本發明的顆粒狀含酶制品在含酶動物飼料組合物的生產中的應用。
與此相關，本發明還包括使用本發明的顆粒狀含酶制品作為含酶起始物質生產的含酶飼料組合物；以及以根據本發明的生產方法(上面列出)獲得的或可獲得的含酶動物飼料組合物。
顯而易見的是根據本發明配制的含酶顆粒狀制品也可用于其生產需要本文所述的熱處理的其它(非飼料)含酶組合物的生產中。
進一步可想象到本發明的原則不僅可應用于提高與含酶制品熱處理(例如，蒸汽處理)相聯系的酶活性的保留，而且類似地可用于提高維生素，輔助維生素，氨基酸，藥物(例如，抗生素或生長調節物質)，無機物添加劑等的穩定性或提高微生物(例如，細菌或真菌)的活力，即在熱處理(例如，蒸汽處理)摻入這些物質的顆粒制品后。
本發明以在下面材料和方法部分給出的實施例進行了進一步的說明，但不是在任何程度上進行限制。
材料和方法T顆粒制品的一般描述正如以前所述，“T顆粒”型顆粒在美國4,106,991中進行了特征描述。
在下面實施例1和2中描述的包被T-顆粒(它們均是顆粒的實例，其中所需的疏水物質摻入包被中)采用下面的起始物質以下文所述的一般方法來制備1)纖維素纖維(ArbocelTMBC200)，2)磨細的“填充劑”(對于本發明的制品，其包含一種或多種本發明的不溶于水的物質)，3)糊精(TACKIDEXTMGM155或AVIDEXTM28LA21)和/或另一種糖類結合劑，及4)酶的水溶液。〔進一步的細節參考實施例1和2(見下文)〕。
在裝備有必需的混合漿和旋轉刀的Lodige混合器中進行制粒。
在將纖維素纖維與填充劑及部分結合劑徹底混合后，將含酶水溶液和剩余結合劑噴灑進混合器中，通過旋轉刀的作用導致形成粒狀顆粒。
然后將顆粒轉移進流動床干燥器中進行干燥，之后將干燥的顆粒冷卻并過篩。
用含疏水物質的包衣包被所得T顆粒狀顆粒也在Lodige混合器中進行。
將干燥的粒狀顆粒加熱到大約70-85℃范圍內的溫度，通常是75-85℃(取決于所用的疏水成份的熔化特征)。熔化疏水成份并在混合器中均勻噴灑到粒狀顆粒上。以EP 0569468 B1所述的方式摻入第二填充劑。應用疏水成份和填充劑后，將所得的T型顆粒冷卻到環境溫度并過篩以去掉極細顆粒和不需要的大型顆粒。
在下文給出的實施例中采用的所有T顆粒主要顆粒大小(直徑)為0.3-1.2mm范圍。測定本發明的制品中疏水物質總含量的試驗將大約10克所述制品(精確重量W克)在緊密封閉的容器中的50ml二氯甲烷中20-25℃間歇式攪拌大約4小時，加入50ml等份的正己烷，然后再密封容器，攪拌并使之靜置幾小時，直到上部液相清澈。將10ml澄清液相樣品轉移到50ml已知重量(到4位小數)的玻璃燒杯中，使溶劑完全蒸發。然后再稱重燒杯(也到4位小數)以測定蒸發后殘留物的重量(R，以克為單位)。
然后疏水物的總含量百分數計算為〔(R×10)/W〕×100。測定本發明的制品中不溶于水的物質總含量的試驗大約10g所述制品(精確重量W克)在密閉容器的50ml去離子水中20-25℃攪拌2小時。離心所得懸液/漿液樣品、采用°Brix量度經折光術測定澄清上清中干固體含量的百分數S，精確到0.1％。
于是不溶于水的物質總含量百分數計算為100-〔(S×50)/W〕。實施例1含植酸酶的粒狀制品的制備以 T-顆粒化程序(見上文)制備了5種不同的含植酸酶的顆粒。在該顆粒化中使用的植酸酶溶液與產品植酸酶Novo L(見Novo Nordisk產品目錄B-722a，可從丹麥Novo NordiskA/S，Bagsvaerd索取)的生產中所用的植酸酶溶液來自相同來源。植酸酶Novo L是具有標準化植酸酶活性的液體酶配制品。
使用所限定量(以干物質為基礎給出)的下列組份制備分別命名為PA，PB，PC，PD和PE的5種顆粒顆粒PA(包被的)組份占制品的％w/w核心 包衣氯化鈉 54高嶺土 3 9纖維素纖維 9碳酸鈣9糊精+蔗糖+酶 8氫化牛脂 9從上表顯而易見的是在顆粒PA中所用的主要填充劑是水溶性鹽氯化鈉，疏水物質(氫化牛脂)和不溶于水的物質(氫化牛脂+高嶺土+纖維素+碳酸鈣)總含量分別為9％w/w和39％w/w。該值與采用上述測定程序測定的值非常吻合(分別為8％w/w和37％)。使用NovoNordisk分析法KALSM-0403.01/01(可從丹麥Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd索取)測定粒狀PA的植酸酶活性為2400FYT/g。
顆粒PB(未包被的)組份 占制品的％w/w纖維素纖維11碳酸鈣73糊精+酶 16從該表中顯而易見的是，顆粒PB中使用的主要填充劑是不溶于水的鹽碳酸鈣，不溶于水的物質總含量為84％w/w。該值與采用上述用于不溶于水的物質的測定程序測定的值(84％w/w)完好地吻合。未使用疏水物質(如本文所限定的)這與使用上述用于疏水物質的測定法發現的疏水物質＜1％w/w相吻合。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0403.01/01(見上文)測定顆粒PB的植酸酶活性為1760FYT/g。
顆粒PC(包被的)組份占制品的％w/w核心 包衣高嶺土 7纖維素纖維 6碳酸鈣 54 7糊精+酶 12氫化牛脂11從該表中顯而易見的是，在顆粒PC中使用的主要填充劑是不溶于水的鹽碳酸鈣，疏水物質(氫化牛脂)和不溶于水的物質(氫化牛脂+高嶺土+纖維素+碳酸鈣)分別是11％w/w和87％w/w。該值與采用上面所述的測定程序測定的值(分別為10％w/w和87％)非常吻合。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0403.01/01(見上文)測定顆粒PC的植酸酶活性為950FYT/g。顆粒PD(包被的)組份 占制品的％w/w核心包衣高嶺土 6.3 7.8纖維素纖維 9.4碳酸鈣7.8磷酸氫鈣48.5糊精+酶 14.5氫化棕櫚油5.5從該表顯而易見的是，在顆粒PD中所用的主要填充劑是不溶于水的鹽磷酸氫鈣(CaHPO4)，疏水物質(氫化棕櫚油)和不溶于水的物質(氫化棕櫚油+高嶺土+纖維素+碳酸鈣+磷酸氫鈣)的總含量分別為5.5％w/w和79.8％w/w。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0403.01/01(見上文)測定顆粒PD的植酸酶活性為1430FYT/g。顆粒PE(包被的)組份 占制品的％w/w核心 包衣高嶺土5.1 9.3纖維素纖維7.9碳酸鈣 9.3硫酸鈉(無水) 42.8糊精+酶 17.1氫化棕櫚油 8.5
從該表顯而易見的是，在顆粒PE中采用的主要填充劑是水溶性鹽硫酸鈉，疏水物質(氫化棕櫚油)和不溶于水的物質(氫化棕櫚油+高嶺土+纖維素+碳酸鈣)的總含量分別是8.5％w/w和40.1％w/w。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0403.01/01(見上文)測得顆粒PE的植酸酶活性為2400FYT/g。實施例2含木聚糖酶顆粒制品的制備以T-顆粒化程序(見上文)制備了5種不同的含木聚糖酶的顆粒。在該顆粒中使用的木聚糖酶溶液與在產品Bio-FeedTMwheat L(參見，例如Novo Nordisk出版物B-854a，可從丹麥Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，索取)的生產中所用的酶來自相同的來源。Bio-FeedTMwheat L是具有標準化木聚糖酶活性的液態酶配制品。
使用以所限定量(以干物質為基礎給出)的下列組份制備分別命名為XA，XB，XC，XD和XE的5種顆粒顆粒XA(包被的)組份 占制品的％w/w核心包衣硫酸鈉(無水)55纖維素纖維 7碳酸鈣 3 18糊精+酶 10氫化牛脂 8從上表顯而易見的是，在顆粒XA中所用的主要填充劑是水溶性鹽硫酸鈉，疏水物質(氫化牛脂)和不溶于水的物質(氫化牛脂+纖維素+碳酸鈣)的總含量分別是8％w/w和36％w/w。該值與采用上文所述測定程序測定的值(分別為9％w/w和36％)非常吻合。使用NovoNordisk分析法KAL-SM-0356.01/01(可從丹麥Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，索取)測定顆粒XA的木聚糖酶活性為810FXU/g。顆粒XB(包被的)組份占制品的％w/w核心包衣硫酸鈣 54高嶺土3纖維素纖維7碳酸鈣 18糊精+酶 9氫化牛脂 8從該表顯而易見的是，在顆粒XB中所用的主要填充劑是不溶于水的鹽硫酸鈣，疏水物(氫化牛脂)和不溶于水的物質(氫化牛脂+硫酸鈣+高嶺土+纖維素+碳酸鈣)總含量分別是8％w/w和90％w/w。該值與采用上述測定程序測定的值(分別為8％w/w和90％)完全吻合。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0356.01/01(見上文)測定顆粒XB的木聚糖酶活性為770FXU/g。顆粒XC(未包被的)組份占制品的％w/w硫酸鈉(無水) 76纖維素纖維11碳酸鈣 6糊精+酶8從該表顯而易見的是，顆粒XC中所用的主要填充劑是水溶性鹽硫酸鈉，不溶于水的物質總含量為17％w/w。采用上面所述用于不溶于水的物質的測定程序測定的值為23％w/w。未使用疏水物質(如本文所限定的)，這與使用上述用于疏水物質的測定所發現的疏水物質＜1％w/w一致。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0356.01/01(見上文)測定顆粒XC中的木聚糖酶活性為1080FXU/g。顆粒XD(未包被的)組份 占制品的％w/w硫酸鈣 73高嶺土 4纖維素纖維 10糊精+酶12從該表顯而易見的是，在顆粒XD中所用的主要填充劑是不溶于水的鹽硫酸鈣，不溶于水的物質的總含量為87％w/w.這與上面所述用于不溶于水的物質的測定程序測定的值(88％w/w)較好地吻合。未使用疏水物質(如本文所限定的)，這與上述用于疏水物質的測定所發現的疏水物質＜1％w/w一致。使用Novo Nordisk分析方法KAL-SM-0356.01/01(見上文)測定顆粒XD的木聚糖酶活性為1090FXU/g。顆粒XE(未包被的)組份 占制品的％w/w核心包衣纖維素纖維 8碳酸鈣 54 18糊精+酶 12氫化牛脂 8從上表顯而易見的是，在顆粒XE中所用的主要填充劑是不溶于水的鹽碳酸鈣，疏水物質(氫化牛脂)和不溶于水的物質(氫化牛脂+纖維素+碳酸鈣)總含量分別為8％w/w和88％w/w。該值與采用上面所述的測定程序測定的值(分別為6％w/w和90％w/w)相當吻合。使用Novo Nordisk分析法KAL-SM-0356.01/01(見上文)測定顆粒XE的木聚糖酶活性為410FXU/g。
實施例3
蒸汽加熱對含植酸酶的飼料配制品的植酸酶活性的影響檢查分別摻入了含植酸酶顆粒制品PA，PB，PC，PD和PE(見實施例1)之一的飼料配制品蒸汽加熱后酶活性的保留程度選擇如下組成(w/w)的谷糠飼料配制品62％的小麥15％大豆粉12％大麥7％魚粉2％大豆油1％碳酸鈣1％磷酸二鈣0.2％ SolivitTMMikro 106**商用維生素/無機物添加劑對于每種含植酸酶的顆粒制品PA，PB，PC，PD和PE，所述制品徹底混合進部分上述飼料配制品中。如果是顆粒PA，PB和PC，所用的混合比率是使最終飼料配制品中植酸酶活性的范圍為大約1500-2500 FYT/kg的比率，而如果是顆粒PD和PE，混合比率是使最終飼料配制品中植酸酶活性范圍為大約3000-4000FYT/kg。使用如下所述的Novo Nordisk分析法DE-9513614測定5種所得的富含植酸酶的飼料配制品中每一種的樣品植酸酶活性。以相同的方式測定未加入含植酸酶的制品的上述飼料配制品的樣品的內源性植酸酶活性，從各種富含植酸酶的飼料配制品的值中減去該值。分析方法1.分析原理和單位定義在Novo Nordisk分析法ED9513614中，在水溶液中從飼料提取植酸酶，然后在標準條件(溫度37℃，pH5.5的乙酸緩沖液，反應時間為60分鐘，起始植酸濃度為5mM)下使酶與肌醇6磷酸(植酸)反應。終止反應，經過加入在硝酸中的鉬酸鹽/釩酸鹽測定無機磷酸。在加入植酸前經過加入鉬酸鹽/釩酸鹽/硝酸測定空白值。用磷酸鹽標準品將試驗標準化。在這些標準條件下1FTU的植酸酶每分鐘產生1μmol的PO43-。2.范圍該測定適于測定含＞50FTU/kg的動物飼料植酸酶活性。3.設備表i)具有2位小數的數值顯示的pH計，裝配有適當的電極。pH計用于檢查和調節緩沖液和底物溶液的pH。
ii)提供在415nm下吸光率(光密度OD)的3位小數的數字閱讀顯示的分光光度計，裝配有10mm比色皿。
iii)能維持37±0.2℃的恒溫水浴。
iv)能提供大約2000rcf的離心機(大約3000rpm的典型臺式離心機)。離心機用于a)從飼料提取物中分離不溶性物質塊以利于取樣，b)產生清澈的溶液用于分光光度術測量。
v)玻璃離心管。
vi)磁力攪拌器。
vii)天平，能稱重限定量±1％。
viii)渦旋混合器。
ix)容量儀器需要一定量的重復吸管，分配器和容量玻璃器皿。所用的裝置應傳遞限定體積±1％內的量。4.化學藥品表冰乙酸(100％)，p.a，Merck 63.
氨溶液25％，p.a，Merck 5432.
四水七鉬酸銨，p.a，Merck 1182.
單釩酸銨，p.a，Merck 1226.
二水氯化鈣，p.a.，Merck 2382.
硝酸65％，p.a.Merck 456.
磷酸二氫鉀，p.a.，Merck 4873三水乙酸鈉，p.a.Merck.6267.
植酸鈉，來自水稻，Sigma.P-3168。5.試劑表5.1.稀釋的硝酸1體積的硝酸(65％)用2體積的水稀釋。在室溫下貯存時間無限。5.2.七鉬酸銨試劑稱取100.0g(NH4)6MO7O24·4H2O。溶于大約800ml水中。加入10ml 25％的氨溶液。加水至終體積為1000ml。在黑暗中室溫貯存。最大貯存時間8周。5.3.釩酸銨試劑稱取2.35g NH4VO3。完全溶于預熱到50-60℃的400ml水中。然后加入20ml稀釋的硝酸(見上面5.1)。加入水至終體積為1000ml。在黑暗中室溫下貯存。最大貯存時間8周。5.4.MoV終止試劑1體積的鉬酸銨試劑(見上面5.2)中加入1體積的釩酸銨試劑(見上面5.3)。然后加入2體積稀釋的硝酸(見上面5.1)。混合物在室溫下貯存。每天新鮮制備。5.5.乙酸緩沖液，pH5.5大約4500ml水中溶解150.1g三水乙酸鈉和0.735g CaCl2·2H2O。用乙酸(大約10ml冰乙酸)調pH至5.50±0.02。加水至終體積為5000ml。室溫下貯存。最大貯存時間1周。使用當天檢查且如果需要調pH。5.6.10％氯化鈣溶液稱取100g CaCl2·2H2O溶于水中。加水至終體積1000ml。貯存于室溫。最長貯存時間無限。5.7.植酸底物溶液稱取1.40g植酸鈉。溶于200ml乙酸緩沖液(見上面5.5)中。經過加入稀釋的乙酸(相應于大約0.4ml冰乙酸)在室溫下調pH至5.50±0.02。用乙酸緩沖液(見上面5.5)稀釋至終體積250ml。假定植酸鈉是十水合物，分子量為1104，那么該底物溶液含5.1mM植酸。每天制備新鮮溶液。5.8.磷酸鹽貯存標準溶液(50mM)，大約10g KH2PO4在105℃的真空爐中干燥2小時。貯存于干燥器中。精確稱取682mg干燥的KH2PO4。溶于100ml乙酸緩沖液(見上面5.5)中。貯存于0-5℃。最長貯存時間1周。5.9.10mM磷酸標準用乙酸緩沖液(見上面5.5)將10ml磷酸鹽貯液標準溶液(5.8)稀釋到50ml。每天制備新鮮溶液。6.飼料樣品例如使用家用咖啡磨將飼料的代表性樣品磨成粉末。7.方法7.1.飼料提取稱取40.0±0.25g飼料粉末。加入500ml含16ml 10％氯化鈣溶液(見上面5.6)的去離子水。劇烈攪拌60分鐘。轉移大約5ml進玻璃離心管中。以3000rpm離心，例如，5分鐘。準備一系列玻璃試管。每個飼料樣品需要4只試管(注意這些試管將在酶反應階段后離心—因此應選擇其大小和質量)。吸出100μl離心的飼料樣品進入4只管的每管中。
7.2.分析在開始樣品提取程序后不超過90分鐘時開始分析程序。2個試管用于酶反應，2個用作空白。還準備了4只試管，各含100μl10mM磷酸鹽標準品(見上面5.9)，且4只試管含100μl乙酸緩沖液(見上面5.5)。這些均按與酶樣品試管相同的方式處理。
酶樣品，磷酸鹽標準和緩沖液間隔15秒。在0時間(t＝0)，加入3.0ml植酸底物(5.7)，混合并放入37℃水浴中。在t＝60分鐘時，加入2.0ml終止試劑(見上文5.4)，混合并使在室溫下靜置。酶空白隨著所有這些樣品開始，制備空白如下加入2.0ml終止試劑(見上文5.4)，接著立即加入3.0ml植酸底物(見上面5.7)；混合并使在室溫下靜置。在t＝70-90分鐘時，以3000rpm離心所有試管10分鐘。在t＝最大值120分鐘時，使用水作參照測量415nm下的OD。8.計算對于每種樣品和磷酸鹽標準品，以一式二份計算平均值且經減去空白值計算ΔOD415(磷酸鹽標準品的空白值是緩沖液樣品的測定值)。
10mM磷酸鹽標準溶液的濃度“P”mM(來自所用的KH2PO4重量并稀釋度)。
在磷酸鹽標準試驗中PO43-的mmol“P×0.1”。
ΔOD415磷酸鹽標準“A”在測定中的樣品重(來自稱重，使用的稀釋度和最終體積)“E”g。
樣品的ΔOD415“B”。
以每g樣品每分鐘釋放的磷酸鹽μmol計算樣品植酸酶活性。樣品植酸酶活性，FTU/g＝(B×P×0.1)/(A×E×60)。8.1.實例在500ml水加16ml CaCl2溶液中提取40.2g飼料。飼料濃度＝0.0779g/ml或0.00779g/100μl。
OD415飼料樣品試驗＝0.506OD415飼料樣品空白＝0.252ΔOD415飼料樣品＝0.254。
磷酸標準液的實際濃度＝9.62mM100ml中的磷酸鹽＝0.962μmolOD415飼料樣品試驗＝0.563OD415飼料樣品空白＝0.197ΔOD415飼料樣品＝0.366。
飼料樣品植酸酶活性＝(0.254×0.962)/(0.366×0.00779×60)＝1.428FTU/g。9.注意9.1.釩酸鹽毒性釩酸鹽(+5價氧化狀態的釩)有劇毒(在大鼠中的口服LD50為18mg/kg)。MoV終止試劑含0.6mg/ml釩酸鹽。最終試驗溶液(需要大多數處理，包括離心)含0.24mg/ml釩酸鹽(和約2％HNO3)。9.2.在飼料測定中加入鈣在用于飼料樣品的上述方法中包含鈣添加。在樣品制備步驟期間鈣的加入減少了游離磷酸的生產，即，減小了空白和酶OD值。9.3.磷酸鹽標準品在高達至少1.5的OD415時磷酸鹽反應是線型的。磷酸鹽標準品測量值可重復性極好，僅使用1個磷酸鹽濃度足以產生精確的校準。10mM磷酸鹽標準品的ΔOD415接近0.37。9.4.最大樣品濃度OD415應不超過0.8。如果獲得更高的值，可建議調節樣品稀釋度。例如，使用1000ml去離子水代替7.1中的500ml(見上文)。蒸汽加熱對于部分各富含植酸酶的飼料配制品以及未加植酸酶的部分飼料配制品進行蒸汽加熱程序，其中蒸汽加熱程序的條件與典型飼料制丸過程中所用的相似將所述100g飼料配制品轉移到布氏漏斗(Schott Duran 21341 44 05)中并通過漏斗傳遞蒸汽并由此通過在漏斗中容納的飼料配制品來加熱。蒸汽加熱持續30秒，其間均勻攪拌飼料。在所有行程中蒸汽的供應保持恒定且足以使飼料配制品在30秒加熱結束時的溫度達到＞85℃。然后將加熱的飼料配制品倒出漏斗并冷卻到環境溫度。
使用Novo Nordisk分析法ED-9513614(見上文)測定各蒸汽加熱的飼料配制品的樣品的植酸酶活性，且經過減去對未加植酸酶制品的蒸汽加熱的飼料配制品測定的殘余內源性植酸酶活性來校正各蒸汽加熱的富含植酸酶的制品的活性。
在各蒸汽加熱的富含植酸酶的飼料配制品中植酸酶活性保留的百分數在下表給出加入飼料配制品中的植酸酶活性的保留(％)含植酸酶的顆粒PA14PB14PC68PD56PE39這些結果表明使用顆粒PC或顆粒PD(兩者均是根據本發明的制品且具有高含量的不溶于水的物質，包括疏水物質)導致在蒸汽加熱過程中酶活性的保留顯著高于對顆粒PA，PB和PE(這些組合物在本發明的范圍外)所觀察到的活性保留。
實施例4蒸汽加熱對含木聚糖酶的飼料配制品木聚糖酶活性的影響檢查分別摻入含木聚糖酶顆粒制品XA，XB，XC，XD和XE(見實施例2)之一的飼料配制品蒸汽加熱后酶活性的保留程度。具有實施例3中所述的(見上文)相同基本組成的谷糠飼料配制品用于該目的。
對于每種含木聚糖酶的顆粒制品，將所述制品摻入飼料配制品中以產生最終木聚糖酶活性范圍為大約800-1000FXU/kg。如果是顆粒XA和XB，經過將相當于96000FXU的顆粒量混合進10kg飼料配制品中來進行；然后將部分所得富含酶的飼料與110kg基礎飼料配制品徹底混合，產生總共120kg的計算活性為800FXU/kg的物質。如果是顆粒XC，XD和XE，制備較小批量(＜1kg)的富集飼料配制品。
使用下面所述的Novo Nordisk分析法ED-9511460.2測定5種所得的富含木聚糖的飼料配制品中每一種的樣品木聚糖酶活性。分析方法1.分析原理在Novo Nordisk分析法ED-9511460.2中，從飼料樣品提取木聚糖酶進入水溶液中。然后使該酶與修飾的小麥木聚糖反應。該小麥木聚糖已被交聯(使其不可溶)并經過與藍色染料偶聯染色，且它能以片劑形式獲得。在標準化條件(溫度為70℃，pH6.0，反應時間是120分鐘)下進行反應。然后經增加pH值來終止。過濾溶液并以分光光度法測量溶液的藍色，它是酶催化的底物溶解的測量值。經過不加酶樣品進行測定來測量空白值。經過向飼料樣品加入已知酶活性校準該試驗。由于加入酶活性而使反應的增加用于計算飼料樣品的活性。
2.范圍該試驗適合于測量含50-250FXU/kg的飼料Bio-FeedTM小麥L木聚糖酶活性。如果調節濃度和稀釋度，還可測定更高的活性。本文包括每kg活性范圍200-1000FXU的指示。
3.設備表i)pH計，具有2位小數的數字閱讀顯示，裝備有合適的電極。pH計用于檢查并調節緩沖溶液的pH。ii)分光光度計，提供在585nm下吸光度(光密度OD)的3位小數的數字閱讀顯示，裝備有10mm比色皿。iii)實驗室臺式離心機，用于分離飼料提取物中的不溶性物質塊以幫助取樣。iv)用于盛5-10ml樣品的離心管v)恒溫水浴，可維持在70±0.5℃。vi)渦流混合器。vii)磁力攪拌器。viii)玻璃纖維濾器，Whatman GF/C，9cm直徑。ix)天平，能稱重限定量至±1％內。x)容量裝置需要一定量的重復吸管，分配器和容量玻璃器皿。所用的裝置應傳遞限定體積±1％的量。xi)玻璃試管，例如15mm×100mm，有蓋。4.化學藥品表二水磷酸氫二鈉，p.a，例如Merck 6580.
一水磷酸二氫鈉，p.a，例如，Merck 6346.
三(羥甲基)甲烷，例如，Sigma 7-9.Sigma T-1378.
木聚糖酶AX，木聚糖酶測定片劑，澳大利亞Megazyme Pty有限公司。
Bio-FeedTM小麥L(具已知活性的木聚糖酶制品)，Novo NordiskA/S，丹麥。
5.試劑表5.1.磷酸鹽緩沖液，pH6將60.0g NaH2PO4·H2O和11.6gNa2NPO4·2H2O溶于大約4500ml水中。用1N HCl或1N NaOH調pH至6.00±0.05。稀釋至終體積為5000ml。室溫下貯存。最大貯存時間1周。5.2.Tris終止試劑將10.0g三(羥甲基)-甲烷溶于1000ml水中。室溫下貯存。最大貯存時間1周。5.3.酶標準溶液從Bio-FeedTM小麥L(具有已知的木聚糖酶活性)制備具有精確已知活性的在4.8-5.2FXU/ml范圍內的緩沖溶液。例如，如果Bio-FeedTM小麥L產品具有500FXU/g，精確稱重大約1000mg并溶于100ml磷酸鹽緩沖液(見上面5.1)中。在室溫下貯存。最長貯存時間2小時。6.飼料樣品“飼料樣品”是實驗室收到的飼料的完整樣品。
用于Bio-FeedTM小麥木聚糖酶測定的樣品FXFX是100g取自“飼料樣品”的樣品。用于取出FX的程序必須保證它是有代表性的樣品。將FX磨成粉末，然后用于該測定。對于對相同“飼料樣品”的重復測定，應重復全部取樣程序。
7.方法稱取飼料FX的2個樣品，各40±0.4g。標記為“a”和“b”。在隨后的程序中以相同的方式處理兩個樣品。在時間0時(t＝0)；加入800ml水并開始攪拌。在時間t＝30分鐘，取大約5ml并轉移進離心管中。標記為“aS”和“bS”。
加入1.0ml的酶標準溶液(見5.3，上文)并連續攪拌。在時間t＝45分鐘，取大約5ml并轉移進離心管中。標記為“aE”和“bE”。以大約3000rpm離心所有4只管5分鐘。
準備16只玻璃試管，各含2.0ml磷酸鹽緩沖液(見上文5.1)。從1至16連續標記。這些試管使用如下試管1-3測定樣品“aS”試管4空白試管5-7測定樣品“aE”試管8空白試管9-11測定樣品“bS”試管12空白試管13-15測定樣品“bE”試管16空白將200μl飼料提取物離心液轉移進各自的測定試管中。用渦流混合器混合。向空白管中加入200μl磷酸鹽緩沖液(見上文5.1)。
樣品提取開始60-90分鐘后開始如下測定程序在各管間使用方便的時間間隔，只管的每管中加入1片木聚糖酶AX16，蓋好試管并將其放置于70℃水浴中。注意加入片劑后不以任何方式混合是重要的。
在水浴中120分鐘后，試管處理如下取出試管，加入5ml Tris終止試劑(見上面5.2)，再蓋好蓋且用渦流混合器充分混合內容物。使所有試管室溫靜置15分鐘，然后再混合并通過Whatman GF/C濾器過濾進干凈的試管中。測量所有16個樣品在585nm下的OD值。過濾后30分鐘內完成這些測量。8.計算計算“aS”，“bS”，“aE”和“bE”測定的OD585平均值(各為3個測量值的平均)。計算空白OD585的平均值。經過從相應的平均測定值減去平均空白值計算“aS”，“bS”，“aE”和“bE”的ΔOD。
計算(以FXU/kg飼料)在提取過程中加入飼料樣品的酶活性(例如，具有5FXU/ml的1ml加入40g飼料中產生125FXU/kg)。
計算飼料樣品“a”和“b”的活性FXU/kg飼料，樣品“a”＝(ΔOD，aS)×(所加的酶，FXU/kg)/[(ΔOD，aE)-(ΔOD，aS)]FXU/kg飼料，樣品“b”＝(ΔOD，bS)×(加入的酶，FXU/kg)/[(ΔOD，bE)-(ΔOD，bS)]“飼料樣品”的木聚糖酶活性以“a”和“b”的平均值給出。9.具有200-1000FXU/kg的飼料樣品的指示將酶標準溶液(見上面5.3)的濃度從5增加到20FXU/ml。將測定中所用的飼料提取物離心液的體積從200μl減小到50μl。無需進行其它的修改。制丸/蒸汽加熱如果分別使用顆粒XA和XB制備含木聚糖酶的飼料配制品，使用導向刻度蒸汽調節器(裝備有漿片和蒸汽入口的連續水平混合器)將該配制品制丸。通過調節器的流速為200kg/小時，在調節器中的停留時間為30秒，調節蒸汽輸入使輸出飼料的蒸汽溫度為95℃。飼料從調節器的出口進入Simon Heesen擠壓器并擠壓使其通過具有3mm×35mm孔大小的模子以成小丸。將小丸樣品轉移到冷卻器中并在空氣中冷卻到環境溫度。取冷卻小丸的樣品用于木聚糖酶活性分析。
如果分別使用顆粒XC，XD和XE制備含木聚糖酶的飼料配制品，采用與實施例3中所述相似的蒸汽加熱程序。在所有行程中蒸汽的供應保持恒定且在30秒加熱期間末足以使飼料配制品的溫度達到＞90℃。然后將加熱的飼料配制品倒入漏斗中并冷卻到環境溫度。
使用Novo Nordisk分析法ED 9511460.2(見上文)測定各蒸汽加熱的飼料配制品的樣品木聚糖酶活性。
在各蒸汽加熱過的富含木聚糖酶的飼料配制品中木聚糖酶活性保留的百分數在下表給出加入飼料配制品中的保留的木聚糖酶活性(％)含木聚糖酶的顆粒XA35XB93XC10XD40XE85這些結果表明使用顆粒XB和XE(它們均是本發明的制品且具有高含量的不溶于水的物質，包括疏水物質)導致在制丸過程中蒸汽加熱期間或其它蒸汽加熱過程中酶活性的保留高于在顆粒XA，XC和XD(該組合物在本發明的范圍外)所觀察到的酶活性保留。
權利要求
1.一種顆粒狀含酶制品，包含共至少1％重量(w/w)的一種或多種疏水物質；共至少75％w/w的一種或多種不溶于水的物質，包括所說的疏水物質。
2.權利要求1的制品，包含至少5％w/w的所說的疏水物質。
3.根據權利要求1或2的制品，包含至少90％w/w的所說的不溶于水的物質。
4.根據權利要求1-3中任一項的制品，包含基本上均勻分布于所說制品顆粒物質中的5-95％w/w的所說的疏水物質。
5.根據權利要求1-3中任一項的制品，包含含酶核心和含所說疏水物質并包圍所說含酶核心的包衣層。
6.根據權利要求5的制品，包含1-50％w/w的所說的疏水物質。
7.根據權利要求5或6的制品，包含5-15％w/w的所說的疏水物質。
8.根據前述權利要求任一項的制品，包含選自無機鹽和多糖的物質作為不溶于水的物質。
9.根據權利要求5-7中任一項的制品，包含選自無機鹽和多糖的物質作為不溶于水的物質。
10.根據權利要求9的制品，其中所說的含酶核心包含纖維形式的纖維素。
11.根據權利要求1-10中任一項的制品，其中所說的酶是選自植酸酶，磷酸酯酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，α-半乳糖苷酶，α-淀粉酶，β-淀粉酶，纖維素酶，果膠酶和肽酶的一種酶。
12.生產含酶動物飼料組合物的方法，其中對權利要求1-11中任一項的含酶制品與最終飼料組合物中的其它成份的混合物進行蒸汽加熱步驟。
13.根據權利要求12的方法，包含將所說的最終飼料組合物制丸的步驟。
14.將根據權利要求1-11中任一項的顆粒狀含酶制品在生產含酶動物飼料組合物中的應用。
15.一種使用權利要求1-11中任一項的制品作為含酶起始物質生產的含酶動物飼料組合物。
16.可由權利要求12或13的方法獲得的含酶動物飼料組合物。
全文摘要
一種顆粒狀的含酶制品,含有共至少1%重量(w/w)的一種或多種疏水物質;共至少75%(w/w)的一種或多種不溶于水的物質,包括所述疏水物質。該制品適用于例如生產動物飼料組合物。
文檔編號A23K1/165GK1201372SQ96197980
公開日1998年12月9日 申請日期1996年11月1日 優先權日1995年11月2日
發明者K·吉布桑, P·E·詹森, K·B·萊夫倫格, P·B·阿斯穆爾 申請人:諾沃挪第克公司